目的腰椎间盘突出症是骨科的常见病和多发病,也是腰腿痛的主要原因,严重影响了人们的生活质量,并且丢失大量的社会劳动力,给社会带来沉重的负担。般认为椎间盘突出是在椎间盘退变的基础上发生的,其共同特征是髓核内蛋白多糖含量的减少,因此可以通过生长因子刺激髓核细胞增加蛋白多糖的合成,减少分解来缓解甚至逆转退变的过程。随着基因强化组织工程学的发展,对椎间盘退变进行分子水平上的治疗成为可能,本实验通过采用基因治疗的两种方法：干细胞体外基因修饰和直接体内转染椎间盘细胞,使其在髓核组织内持续表达GDF-5,来对延缓椎间盘退变的效果进行比较,以期为临床应用基因疗法治疗椎间盘退变提供依据。方法(一)经超顺磁性氧化铁标记的自体BMSCs在兔椎间盘内存活时间的研究1、兔BMSCs分离培养及检测采用密度梯度离心法,分离、纯化兔骨髓间充质干细胞,进行体外培养扩增,并进行细胞形态学、组织化学染色观察。2、SPIO标记兔BMSCs及检测取第三代原代培养细胞,采用SPIO-PLL复合物标记细胞,并进行细胞普鲁士蓝铁染色、透射电镜检测是否标记成功,MTT法测定标记细胞增殖是否受到影响。3、标记细胞在椎间盘内存活时间的研究实验组和对照组分别注入经SPIO标记和未标记的BMSCs悬液,术后2、4、6、8周,实验组和对照组分别取相应椎间盘行普鲁士蓝铁染色,镜下观察在细胞质内是否出现蓝染颗粒。(二)体内体外两种转染方法对延缓椎间盘退变效果的比较研究1、脂质体介导的pcDNA3.1 (+)/GDF-5重组质粒转染BMSC用倒置显微镜观察细胞的生长情况和形态学变化。2、基因活化基质的制备Ⅰ型胶原支架切成直径1mm长5mm的长条经环氧乙烷消毒后备用,按步骤2的比列稀释质粒和脂质体,将支架放入其中浸泡30min后进行动物手术。3、动物手术后2个月椎间盘退变修复效果检测取术后2个月各组兔椎间盘的髓核,间苯三酚法测蛋白多糖含量,流式细胞仪检测凋亡率。结果(一)兔BMSCs其自体椎间盘中可以持续存活8周1、刚接种BMSCs的培养瓶中为大量圆形细胞,2～3 d出现少数长梭形细胞；5～7 d后圆形细胞消失,长梭形细胞数量逐渐增多,成簇生长,呈放射状排列；10～20 d开始呈对数生长。传至第3代时细胞呈漩涡样生长,扫描电镜显示第3代细胞表面有大量微绒毛,糖原染色呈强阳性,ColⅠ、ALP及脂肪染色均呈阴性。2、经普鲁士蓝铁染色显示阳性细胞胞质内出现蓝染颗粒,透射电镜观察显示胞质内有电子高密度铁颗粒,MTT检测显示7 d内未标记细胞组和SPIO标记细胞组间细胞增殖比较差异无统计学意义。3、术后2周,实验组镜下可见髓核中有大量蓝染颗粒,且位于胞质内；4周,髓核和纤维环均可见到位于细胞质内的蓝染颗粒；6、8周,仍可观见位于胞质内的蓝染颗粒。各时间点对照组椎间盘切片均未观察到蓝染颗粒。(二)体内体外两种转染方法对延缓椎间盘退变效果的比较研究1、转染12小时后可见部分细胞出现凋亡现象,48小时后细胞生长良好,体积略增大。2、转染48小时后各组细胞以及手术后2个月各组椎间盘RTPCR结果如图,pcDNA3.1(+)／GDF-5转染细胞组,回输转染MSC组和GAM组的髓核均在约560bp处有电泳条带,转染成功。3、各组与正常组之间通过方差分析,LSD-t检验,差异有统计学意义,但以转染细胞组修复效果最接近正常椎间盘。结论1、SPIO是一种理想的细胞标记物,可以动态监测标记细胞；兔BMSCs其自体椎间盘中可以持续存活8周。2、转染细胞组修复退变的椎间盘效果最好,但其成本最高。