目的:探讨GLP-1受体激动剂艾塞那肽对高脂饮食和慢性应激诱发的ApoE-/-小鼠血管老化及动脉粥样硬化斑块的影响及其机制。方法:实验1:使用5周龄ApoE-/-雄性小鼠(n = 24)随机分为非应激组和应激组,两组均给予高脂饮食(High fat diet,HFD),应激组利用固定应激模型器,固定压力4小时/日,共12周,非应激组可自由活动。实验2:5周龄ApoE-/-雄性小鼠(n = 22)随机分为(NS组,0.2ml)艾塞纳肽组(Exe组,5 μg/kg),均皮下注射,共12周。两组均每日持续4小时固定压力及高脂饮食。固定压力时间和方法同实验1。第12周末全部实验小鼠心脏采血后取动脉组织,采用ELISA测定脂联素(APN)、瘦素(leptin)、和GLP-1活性;用全自动生化仪检测BUN、NEFA、LDL-C、HDL-C和TG水平;采用化学发光法测定DPP-4活性;病理检查采用HE、油红0、β Gal、胶原蛋白、弹性蛋白染色及免疫组化染色观察AS斑块和血管老化病理改变;采用明胶酶谱、RT-PCR观察炎症和氧化因子 p22phox,gp91phox,MMP-2 和-9,TIMP-1 和-2、CatS、K 和 L,TLR2 和 4,SDF-1 α、CXCR4 及 eNOS 表达;脂肪因子脂联素(adiponectin,APN)的基因表达;采用Western Blot方法检测PPAR-α,AT1R和gp91phox蛋白的表达水平。结果:一.体重(BW)和血生化指标1.与非应激组相比,应激组小鼠腹股沟脂肪和皮下脂肪明显减少,血浆DPP4水平(823±34vs.305±28ng/ml,p<0.01)显著增加,但游离脂肪酸浓度维持较低水平。2.应激组与非应激两组血浆CRE,BUN、LDL-C、HDL-C水平之间没有显著性差异。二.血管衰老和AS病理改变主动脉根部H&E染色定量分析:与对照组相比,应激组主动脉内膜面积(438±25 vs.213±13 ×103 μm2,p<0.01)和新生内膜面积与中膜面积比值(1.9±0.2vs.1.0±0.1,p<0.01)明显增高。油红0染色定量分析:与对照组相比,应激组动脉硬化斑块面积显著增多(209±20 vs.117±10 ×103 μm2,p<0.01)。主动脉根部AS病变特性定量分析:与对照组相比,应激组胶原蛋白的含量(17.0±1.9 vs.38.9±2.3%,p<0.01)和平滑肌 SMC 细胞含量(13.3±0.8vs.19.5±1.4%,p<0.05)明显减少,而弹性蛋白的降解明显增多(15.6±1.5 vs.4.5±0.7,p<0.01)。β-Gal染色血管老化定量分析:与对照组相比,应激组SA-β-Gal活性显著增加(29.0±4.1 vs.10.1±1.9,p<0.01)。三.慢性应激对炎症/氧化应激相关基因和基质蛋白分解酶表达:1.免疫组化分析显示:与非应激组比较,应激组斑块内巨噬细胞、骨桥蛋白表达及新生血管数均明显增加(25.5±2.6%vs.10.2±1.3%,25.6±2.1%vs.9.3±1.0%,7.2± 1.1 vs.3.1±0.5,均 p<0.01)。2.定量PCR分析显示:非应激组比较,应激组血管病变组织内炎症和氧化应激相关基因(TLR-2、TLR-4、CXCR4、SDF-1 α、p22phox 和 gp91phox)的表达均显著增高。除eNOS mRNA水平外,应激组MMP-2和9、TIMP-1和2、CatL,S和K mRNA的表达明显高于非应激组。3.定量明胶酶谱法检测表明:应激组病变组织的MMP-2和9的酶活性增强。4.Western blot凝胶图像和定量分析结果表明:应激组炎症和氧化因子相关蛋白gp91、AT1R和PPAR-α的表达明显增强。四.慢性应激对血浆GLP-1、瘦素和脂联素水平以及脂联素基因表达影响:ELISA检测结果显示:与非应激组比较,应激组GLP-1(9.2±0.8 vs 15.9±1.1 pM,p<0.01)APN(5619 ± 598 vs.7577 ± 382 ng/ml,p<0.05)、Leptin(177±25 vs.402±45 pg/ml,p<0.01)水平下降,皮下脂肪细胞中 APN基因表达显著减少,与血浆检测APN结果一致。五.GLP-1R激活,减轻HF饮食诱导慢性应激引起的血管老化和动脉粥样硬化斑块:油红0染色定量分析:与NS组比较,Exe组AS斑块面积显著减少(145±11 vs.390±19×103/ummm2,p<0.01)。主动脉根部AS病变特性定量分析:与NS组相比,Exe组胶原蛋白(28.1 ±3.1%vs.15.2±1.2%,p<0.01)和血管中膜中平滑肌细胞含量明显增多(17.1±2%vs.12.7±1.3%,P<0.05),而弹性蛋白的降解明显减少(2.4±0.5 vs.9±1.6,P<0.01)。β-Gal染色血管老化定量分析.·与NS组相比,Exe组SA-β-Gal活性显著减少(9.8±1.3%vs.34.1 ±4.0%,p<0.01)。Exe 组与 NS 组血脂、肾功能和体重、皮下脂肪无显著性差异。六.Exenatide对炎症和蛋白水解酶的表达及活性的影响:1.与NS组比较,Exe组主动脉根部AS斑块内巨噬细胞数量(26.2±1.8%vs.45.2±4%)和骨桥蛋白表达量显著减少(16.4±2%vs.38.4±1.4%),新生血管密度也明显降低(2.3±0.3vs6.1 ± 0.9,p<0.01)。2.定量PCR分析显示:与NS组相比,Exe组病变组织内炎症和氧化应激相关基因(TLR-2 和 4、CXCR4、SDF-1 α、p22phox 和 gp91phox’)的表达显著降低,除 eNOSmRNA 表达水平外,MMP-2 和 9、TIMP-1 和 2、CatL、S 和 KmmRNA 的表达明显降低。3.定量明胶酶谱法检测表明,与NS组相比,S-Exe组MMP-2和9的酶活性明显降低。4.Western blot凝胶图像和定量分析结果表明,与NS组相比Exe组gp91phox蛋白水平下降,AT1R和PPAR-’α蛋白表达降低。七.Exenatide对血浆GLP-1、瘦素和脂联素水平以及脂肪组织脂联素基因表达影响:ELISA结果显示:与NS组比较,Exe组血浆APN及瘦素水平明显升高(8065±634 vs 5619±598 ng/ml,p<0.05,367±51 vs 130±17 pg/ml,p<0.01),皮下脂肪细胞中APN基因表达也增加,与血浆APN检测结果一致。结论:慢性应激使血浆中DPP-4浓度升高,降低GLP-1活性,脂肪细胞中APN产生和表达降低,从而促进炎症反应和氧化应激,蛋白水解酶活化,导致高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠血管衰老和AS的发生和发展。本次研究首次证实一种基于肠促胰素的药物-GLP-1R激动剂Exenatide改善与应激相关的血管老化和AS,提示GLP-1/R轴可能是一个与应激相关的心血管疾病的治疗新靶点。目的:探讨血浆DPP4水平与冠心病及其危险因素的关系,为寻找诊断冠心病的新标记物提供实验依据。材料与方法:研究对象:选择2014年5月至2015年12月间以胸痛住院的496例患者,经冠状动脉造影检查后分为冠心病362例和非冠心病134例。根据临床症状、体征和临床检查结果将分以下亚组进一步分析:1.冠心病患者分为急性冠状动脉综合征组(ACS组)299例与稳定型心绞痛组(SAP组)63例。2.根据是否患有糖尿病,冠心病患者分为CADDM(+)组84例与CAD/DM(-)组278例。3.非冠心病病人根据是否患有糖尿病分为nonCAD/DM(+)组22例与nonCAD/DM(-)组112例。排除条件:先天性心脏病,原发性心脏瓣膜病,心肌病,由任何已知的全身因素引起的继发性心肌疾病,或终末期肾脏疾病、服用DPP4抑制剂的糖尿病患者均被排除在外。实验方法:经冠脉造影检查,对所有入组患者收集包括年龄,性别,吸烟史,用药史和既往史(高血压,糖尿病,心肌梗死病史,心脏病病史,搭桥手术病史和脑血管疾病病史);测量体重指数(BMI)和血压;在PCI之前,抽取静脉血液样本,并存储于零下80℃冰箱;用全自动生化仪测定血浆糖化血红蛋白(HbAlc)、高敏C反应蛋白(hs-CRP)、低密度脂蛋白(LDL-C)、肌酐、和高密度脂蛋白(HDL-C)的水平;化学发光法测定DPP-4活性;采用定量冠状动脉造影(quantitative coronary angiogram,QCA)评价冠状动脉狭窄,并进行 SYNTAX评分。结果:患者一般情况分析:1.CAD组非CAD组性别分布有显著性差异(P<0.01),年龄或体重指数组间差异无统计学意义(P>0.05)。2.对照组比较,CAD患者高血压患病率明显高,吸烟史、脑血管病史、既往心肌梗死及PCI手术史患者也表现出较高的CAD患病率(P<0.0 1)。3.与对照组比较,CAD组使用降糖药物(胰岛素),抗血小板聚集,降脂,降压药物患者显著增多(P<0.01)。4.SAP组与UAP+AMI组间年龄、BMI和药物使用情况均无显著差异(均P>0.05)。动脉粥样硬化的病变特征:1.UAP+AMI组与SAP组间左主干的靶病变部位没有显著差异(P>0.05)。2.与SAP组比较,UPA+AMI组病变在左冠状动脉前降支、回旋支和右冠状动脉的例数显著增多(P<0.05)。3.与SAP组QCA的靶病变比较,除了参考管腔直径以外,UPA+AMI组血管狭窄程度明显,病变长度更长,SYNTAX评分更差(87.3 ± 9.2 vs 74.3 ± 7.1mm,P = 0.04,19.1 ± 4.0 vs 15.0 ± 4.4 mm,17.8 ± 7.9 vs 11.9 ± 6.3,均P<0.01)。循环血中的生物标记物:1.非CAD组比较,CAD组血浆DPP4水平显著增加(11.8 ± 3.1 vs 9 ±3.5 ng/L,P<0.01)。2.与非 CAD 组比较,CAD 组 hsCRP 水平和 HbAlc 水平(15.2’ ± 28.9 vs 3.3±9.0ng/mL,P=0.04,6.0 ± 1.5 vs 5.5 ± 1.1%,P<0.01)显著升高。3.CAD组与非CAD组的肌酐和HDL-C水平均无显著性差异(P>0.05)。4.UAP+AMI组患者的循环DPP4水平,与SAP组患者相比显著增加(13.1 ±4.2 vs 9.4 ± 3.8 ng/L,P<0.01)。5.与SAP组相比,UAP+AMI组血浆LDL-C、hsCRP和HbAlc水平显著增高(104.0 ± 31.4vs95.5 ± 29.4mg/d1,P = 0.04,17.8 ± 31.0vs3.0 ±7.2 ng/mL,P<0.01,6.1 ± 1.5 vs5.6 ± 1.0%,P=0.01),两组 HDL-和肌酐水平没均无显著差异(P>0.05)。血浆DPP4活性对糖尿病和冠心病的影响:1.nonCAD/DM(+)组 DPP4 水平明显高于 nonCAD/DM(-)组(8.0±2.9 vs 6.4±3.1 ng/L,P<0.01)。2.CAD/DM(-)组血浆 DPP4 活性明显高于 nonCAD/DM(-)组(10.9±4.9 vs 6.4±3.1 ng/L,P<0.01)。3.CAD/DM(+)组与CAD/DM(-)组DPP4水平无显著性差异(P>0.05)。DPP4活性与冠心病危险因素的多重逻辑回归分析:1.血浆 DPP4 的水平与 LDL-C(r= 0.23,P<0.01)和 hsCRP(r = 0.41,P<0.01)水平呈正相关,而与HDL-C水平负相关(r = 0.05,P>0.05)。血浆DPP4水平与血管管腔狭窄程度(r = 0.24,P<0.05)和病变长度(r = 0.19,P<0.05)呈正相关。2.线性回归分析显示CAD与年龄、性别、hs-CRP、高血压、胆固醇、和 DPP4活性显著相关。多重逻辑回归分析显示血浆中DPP4水平是CAD的独立预测指标(优势比 1.56;95%置信区间 1.19-1.73;P<0.01)。结论:冠心病患者无论有无糖尿病,血清中DPP-4水平明显升高,DPP4升高与冠心病密切相关,有望成为诊断冠心病的新的生物标志物。