海岛棉是世界上棉纤维质量最优的栽培品种,新疆是我国海岛棉主要栽培地区。枯萎病严重影响新疆海岛棉产量及纤维品质。研究海岛棉枯萎病抗性机制将为筛选抗性候选基因、培育海岛棉抗病品种从而为解决枯萎病危害提供支撑。本研究以海岛棉抗枯萎病品系06-146、感病品种新海14（XH 14）以及以它们为亲本构建的四份抗病性不同的F2:6重组自交系为材料,用高致病性枯萎病菌侵染处理,利用RNA-Seq技术进行高通量测序,通过qPCR实验验证数据可靠性,对测序数据分析,筛选差异表达基因,并对差异表达基因进行功能注释及富集分析;同时,进一步利用RNA-Seq测序数据开展海岛棉抗病相关lncRNA及转录因子的研究。具体结果如下:1.通过RNA-Seq测序,得到6份材料的对照组及处理组共12个样品的4亿个原始读长,过滤后获得高质量读长3.5亿个,平均每个样3G数据。样本相关性分析显示接菌处理组、对照组分别聚类,qPCR实验显示尖孢镰刀菌FOTG基因在接菌组检测到表达,抗病相关基因在各样本中均检测到高表达,随机挑选的7个基因的qPCR结果与转录组结果趋势一致,以上均说明海岛棉下胚轴在接菌40h后已响应病原菌侵染。2.差异表达基因分析表明,各材料对枯萎病菌侵染的反应趋势相似,但不同材料间上调、下调基因的数量及类别仍然存在很大差别。各材料在接菌后下调基因数量多于上调基因,感病材料差异基因数量更大。上调和下调在所有感染和对照样品中具有良好的一致性,表明mRNA转录对Fov感染的响应趋势在六个棉花材料中较保守。在两个抗性组中分析获得了 480个co-up DEGs,并在两个易感组中获得了 510个co-up DEGs;在两个抗性组中分析获得了 983个co-down DEGs,并在两个易感组中获得了 1008个co-down DEGs。对这些差异基因注释富集显示,所有样本中抗病相关毒素分解代谢、防御应答、免疫应答、ABC转运子、防御机制相关基因富集性上调表达,表达量与材料抗性相一致;所有样本中类黄酮生物合成基因、糖基转移酶等相关基因富集上调表达,并且富集的显著性与材料的抗性相一致;感病组中光合作用相关基因显著富集下调表达,而抗性组中未检测到光合作用相关基因差异表达,表明抗性组材料中光合系统受到保护,确保了物质能量供给。3.基于以上转录组测序数据,利用陆地棉基因组做参考序列,预测到11336个lncRNA,81.0%是基因间lncRNA,14.4%是内含子lncRNA,4.6%是天然反义lncRNA。lncRNA结构分析显示其平均长度为1042bp,69.2%的lncRNA仅具有一个外显子。随机选取的16个lncRNA的qRT-PCR实验结果与转录组结果高度一致,表明转录组同时能较好的反映lncRNA的表达变化。两亲本间、抗感材料组间、接菌前后lncRNA表达均存在差异,但DE lncRNA的数量与材料抗性并不一致;感病组接菌后下调lncRNA数量明显大于上调。DE lncRNA在对应陆地棉两个亚基因组染色体上分布不均匀,染色体A05、A07、All、D05和D06含有明显的簇,对应位置可以作为响应真菌感染的基因组热点。DE lncRNA的功能富集分析结果表明,接菌后上调的DE lncRNA与棉花中谷胱甘肽代谢、植物激素信号转导和囊泡转运中的SNARE以顺式作用方式共表达,表明海岛棉抗病相关lncRNA可能是通过调控这几条代谢或信号通路而参与海岛棉响应枯萎病侵染。4.基于以上转录组测序数据,利用陆地棉转录因子数据库做参考序列,对各组差异表达基因进行转录因子功能注释,筛选各组差异表达基因中的转录因子基因。各组中共有来自于48个转录因子家族的1315个转录因子在接菌处理后表达量发生变化,其中有来自于39个家族的503个转录因子上调表达,有来自于44个转录因子家族的812个转录因子下调表达。下调表达的数量及家族种类均多于上调。进一步分析6个比对组发现,bHLH、ERF、G2-like、NAC、MYB、SlFa-like这6个转录因子家族在6种材料中上调表达的转录因子数量最多,而bHLH、ERF、G2-like、NAC、MYB、S1Fa-like、WRKY这7个转录因子家族在6种材料中下调表达的转录因子数量最多。分析各组间的重叠差异表达转录因子,发现有来自于1 1个转录因子家族的17个转录因子在所有组均上调表达,有来自于8个转录因子家族的12个转录因子在所有组均下调表达,筛选到的重叠转录因子主要来自于 ARF、ERF、MYB、S1Fa-like 等家族,有 4 个分别来自于 CAMTA、LBD、WRKY、Trihelix 家族的基因在6组中均上调表达。筛选到7个具有品种特异性的差异表达转录因子,有6个分别来自于NAC、G2-like、C2H2、HD-ZIP、AP2、S1Fa-like家族的转录因子只在抗性材料中差异表达,有1个来自于G2-like家族的转录因子只在感病材料中下调表达。