禽流感是由禽流感病毒感染引起的人畜共患传染病,近十多年来,H5亚型高致病性禽流感在全球多个国家均有发生,对家禽业生产和人类健康构成了严重危害。本研究建立了一种基于纳米抗体的禽流感病毒H5亚型ELISA检测方法,为临床上检测该病提供了一种准确、有效的诊断方法。本研究将靶向H5亚型血凝素（HA）纳米抗体核苷酸序列克隆到p ET28a,构建原核表达质粒p ET-NB93,同时将纳米抗体基因序列与碱性磷酸酶（AP）基因序列融合克隆到表达载体上,构建p ET-NB93AP,构建的两个质粒转化大肠杆菌BL21后进行表达,再经SDS-PAGE分析,筛选、确定了重组蛋白的IPTG诱导最佳终浓度为1.0m M,37℃恒温诱导时蛋白表达量最高;之后利用亲和层析方法重组蛋白进行可溶或变复性纯化并优化纯化条件。Western blot结果表明,重组蛋白能与小鼠抗His标签抗体进行反应且没有明显的非特异反应,表明获得的重组蛋白纯度较高。利用NB93和融合蛋白NB93AP分别与禽流感病毒H5亚型r D8株、ZQ105株和D7株进行血凝抑制和鸡胚中和试验。结果显示,NB93对r D8和ZQ105（同为2.3.4.4分支）血凝抑制效价分别达到8log2和7log2,但对D7株（2.3.2分支）没有明显的血凝抑制的效果。复性后的重组蛋白NB93AP对r D8株的血凝抑制效价为2log2。鸡胚中和试验结果表明,重组蛋白NB93对ZQ105株的中和效价为320倍,对D7株的中和效价为0,与血凝抑制试验结果一致,表明NB93对2.3.4.4分支的H5亚型流感病毒有良好的结合作用。将病毒包被后建立检测H5亚型流感病毒的ELISA方法。ELISA的最佳反应程序为:包被的病毒浓度为107个EID50,37℃包被1 h,封闭液为3%BSA,37℃封闭2.5h,酶标一抗的稀释度为50倍,37℃孵育90 min,显色时间为1 h。利用阴性样品OD值的平均数（?）和标准方差（S.D.）,根据统计学原则,当样本的OD620值≥(3+3S.D.时判断为阳性。确定NB93-HRP临界值为0.461,即当OD620值≥0.461时,结果判断为阳性,反之则为阴性;而NB93-AP的ELISA的最佳反应条件基本与NB93-HRP一致,除了NB93-AP的显色时间为10 h,临界值OD410为0.432。用建立的ELISA方法检测阳性样品ZQ105和禽流感病毒H9、H7、H6亚型和H5亚型D7株、小鹅瘟病毒、新城疫病毒、坦布苏病毒,除了ZQ105为阳性反应外,其他的病毒检测结果都是阴性,表明建立的该方法具有良好的特异性。经由NB93-HRP的检测,ZQ105病毒为100个EID50时OD620值仍大于0.461,而NB93-AP的检测为800个EID50时OD410值仍大于0.432,表明该方法具有良好的敏感性。