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蛋白质是所有生命活动的功能执行者,蛋白质正确折叠获得天然构象是其执行功能的前提。在细胞内,某些蛋白在折叠过程中,会出现错误形成沉淀或者被迅速降解。分子伴侣是一类辅助其他蛋白质折叠,但并不组成最终产物的蛋白质。Chaperoin是分子伴侣中的一类,专指分子量为60 kDa的分子伴侣。其功能形式是由60 kDa的蛋白亚基形成的双环结构的寡聚物。依靠ATP的结合与水解作用,两个环交互的结合、包埋变性的底物蛋白,从而实现底物折叠。Chaperoin广泛存在于各类细胞及细胞器中,在细菌和线粒体中(分别命名为GroEL和Hsp60),Chaperoin都是单一亚基组成的复合体,然而,在叶绿体中(命名为Cpn60),却发现了两种不同类型的亚基:α型和β型。在不同的植物中,α型和β型亚基数量不同。至今,叶绿体Cpn60寡聚体的亚基组成以及亚基的功能分化还不清楚。 模式生物莱茵衣藻是单细胞真核生物,能够进行光自养或者异养生长,其基因组信息相对于高等植物要简单,在其基因组中存在3个编码叶绿体Cpn60的基因,一个Cpn60α和两个Cpn60β。我们利用其Cpn60基因少、复杂性低的特点,采用体外生化和体内实验相互验证,综合分析了Cpn60复合体的亚基组成以及Cpn60各亚基的功能特点。 我们从衣藻细胞内分离的Cpn60寡聚体同时含有Cpn60α与两个Cpn60β亚基(Cpn60β1,Cpn60β2),然而,利用大肠杆菌异源表达系统,却发现Cpn60β同源聚合体和以及包含有三种亚基的异源复合体Cpn60αβ1β2都能形成。我们分离纯化了三种寡聚体,Cpn60β1,Cpn60β2以及Cpn60αβ1β2,并分析它们的生理生化特性差异。发现在ATP的作用下,寡聚体Cpn60β2完全解聚成单体,Cpn60αβ1β2部分解聚,而Cpn60β1不解聚。并且,当其他两种单体存在时,同源寡聚体Cpn60β2会改变为异源寡聚体。利用分离纯化的各种亚基的单体蛋白:Cpn60α-M,Cpn60β1-M, Cpn60β2-M,我们进一步分析了Cpn60复合体的重组装。三种亚基在重新组装成复合体的过程中存在很大差异,Cpn60α-M任何情况下都不能形成复合体,而Cpn60β1-M在ATP/ADP存在时极易聚合,Cpn60β2-M则只有在加入ATP和辅因子(SR-GroEL或者GroES)的情况下可以检测到少量复合体的形成,当三种亚基同时存在时,可以促进复合体的形成。我们发现三种Cpn60亚基单体具有不同的ATP酶活性,单体的Cpn60β1-M,Cpn60β2-M亚基均表现出较高的ATP酶活性,Cpn60α-M则完全检测不到ATP酶活性。在ATP水解的作用下,分子伴侣Cpn60寡聚体发生解聚,但另一方面,ATP也促进了Cpn60寡聚体的组装。这些结果表明,ATP调节Cpn60的生物合成。体外的折叠实验发现,Cpn60αβ1β2可以与辅分子伴侣GroES相互作用,折叠变性的深红红螺菌的RrRubisco;而两个同源复合体Cpn60β1,Cpn60β2只有少量甚至没有折叠底物的功能。对大肠杆菌groEL突变体互补实验也发现,只有Cpn60α、Cpn60β基因同时表达时,才能实现对GroEL功能的互补。共表达两种Cpn60β基因时,可以在37℃部分互补GroEL的功能,但在热激条件42℃下,不能互补其功能。而且,不同组合的Cpn60亚基对不同的底物,具有不同的底物折叠效率。这些数据表明,Cpn60αβ1β2是体内存在的功能形式。通过绝对定量质谱,我们测得在体外分离纯化的Cpn60αβ1β2复合体中,α、β1、β2三亚基在复合体中的摩尔比例为4∶7∶3。