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研究背景几乎所有的心脏疾病后期都涉及病理性心肌重构。心肌纤维化是心肌重构的主要表现之一,是多种心脏疾病发展到一定阶段的晚期病理改变。这一病理改变是由于心肌成纤维细胞产生的细胞外基质蛋白过度沉积。纤维化可降低心肌组织的顺应性,使损伤的心脏加速发展为心力衰竭。心肌成纤维细胞是心肌中数量最多的细胞,他们通过产生细胞外基质在纤维化中发挥作用。急性心肌损伤后,心肌成纤维细胞在各种促炎细胞因子和促纤维化因子的作用下,发生细胞增殖,并出现向肌成纤维细胞表型的过渡。这个过程需要核糖体生物合成来保证蛋白质翻译。RNA polymerase Ⅰ(PolⅠ)依赖的核糖体RNA(rRNA)合成对保证细胞稳态有决定性作用。在细胞核仁中,Pol Ⅰ将核糖体DNA转录成为核糖体RNA前体(45spre-rRNA),经过多个步骤的剪切,生成成熟的18S,5.8S和28S核糖体RNA,进而与核糖体蛋白结合形成核糖体大小亚基发挥作用。CX-5461是一种新型的特异性Pol Ⅰ抑制剂。我们以往研究发现CX-5461对损伤引起的动脉血管内膜增生和再狭窄有显著抑制作用。本研究中我们探索了 CX-5461对心肌成纤维细胞功能的影响。研究内容1.心肌成纤维细胞的活化过程中Pol Ⅰ功能的改变:分别采用Cell Counting Kit-8试剂盒、Edu细胞增殖检测法检测细胞增殖;和蛋白印记方法检测蛋白表达水平;采用实时定量PCR方法检测α-smooth muscle actin(α-SMA)、pre-rRNA的表达;采用碱水解法通过检测细胞羟脯氨酸含量来反应胶原的表达水平;采用细胞免疫荧光方法检测活性上游结合因子-1(UBF-1)的磷酸化水平。采用染色质免疫沉淀方法检测细胞rDNA转录活性水平。2.CX-5461对活化的心肌成纤维细胞的药理作用及机制:采用实时定量PCR方法检测a-SMA、pre-rRNA、细胞衰老相关炎症因子的表达;采用碱水解法检测细胞胶原含量。采用细胞免疫荧光方法和蛋白印记方法检测p53、ataxia telangiectasia mutated(ATM)、ataxia telangiectasia and Rad3-related(ATR)的磷酸化水平;采用Comet assay方法检测DNA损伤。实验结果CX-5461能明显抑制血清和血小板源性生长因子(PDGF)诱导的心肌成纤维细胞增殖。同时我们发现用CX-5461处理的细胞发生细胞周期阻滞。用PDGF或转化生长因子-β(TGF-β)或血清诱导心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转变过程中,α-SMA和胶原表达增多,UBF-1和45Spre-rRNA表达也增多。发生纤维化的心肌组织中成纤维细胞中核糖体DNA转录活性显著增加。CX-5461处理能够抑制pre-RNA的表达并抑制细胞的表型转分化过程。CX-5461同样抑制了自然传代引起的细胞表型转变。CX-5461能够增加p53,ATM和ATR的磷酸化水平。ATM加ATR的抑制剂可显著减弱CX-54 61激活p53及抑制细胞增殖的作用。Comet assay未检测到CX-5461能够直接引起DNA损伤。CX-5461能够诱导心肌成纤维细胞出现细胞衰老的表型。p53抑制剂能削弱CX-5461抑制细胞表型转变及促进细胞出现衰老表型的作用。结论CX-5461能够有效抑制心肌成纤维细胞的活化及表型转化,其作用可能与激活ATM/ATR-p53通路有关。因此特异性Pol Ⅰ抑制剂可能为防止心肌纤维化提供新思路。