研究背景目前在整形外科中,修补软组织缺损是我们面临的主要难题。脂肪移植及皮瓣移植是我们现填补缺损主要方式,但这些方式因无法得到高保留率及供区缺损等问题无法得到满意结果。基于组织工程原理的外扩张器(EVE)为我们提供了新的思路。在前期外扩张器动物实验发现解除细胞间接触有助于促进脂肪组织来源干细胞增殖,以及外扩张可引起趋化因子CXCL12增加,募集血液来源间充质干细胞。该实验均证实外扩张(EVE)可为脂肪再生提供种子细胞。同时在前期实验中我们发现,EVE中脂肪再生表现为早期细胞增殖较强而晚期细胞成脂分化的规律模式。但目前EVE中以该规律的脂肪组织再生机制并不清楚,需要我们进一步探究。在前期实验探究中我们同样发现,EVE中脂肪新生伴随自体细胞外基质(ECM)渗出。在组织工程中,ECM可作为支架为种子细胞提供生长环境。并且ECM在胚胎发育,组织再生及组织自稳态调节中发挥着重要的作用。近些年脂肪组织工程研究中,运用不同ECM胶原成分调控细胞定向功能如:迁移,增殖及分化多被报道及运用。因此,我们提出假说:外扩张模型可诱导渗出自体胶原基质,从而调控脂肪组织再生。方法1.动物模型测量SD大鼠重量配置戊巴比妥进行麻醉。固定于手术台,脱毛行术区消毒。大鼠右侧腹股沟行3cm切口,分离脂肪瓣,保留轴心血管,固定于腹白线。最后切口缝合。术区标记脂肪瓣位置。术后1周恢复,检查伤口愈合情况。待伤口愈合后,行负压吸引。外接负压吸引设备,吸引力-25mmHg。实验共有48只体重350±20g SD大鼠。其中24只每日行10小时的负压外吸引,24只用作对单纯手术转瓣对照组。并在第1、4、8、12周收集脂肪组织。2.HE染色、马松染色和免疫组化分析样品石蜡包埋,切成2微米薄片。根据报道的标准流程进行苏木精伊红染色,马松染色。免疫组化的切片进行抗原热修复,并进行一抗过夜。实验所用一抗为Fibronectin、Laminin、Collagen I、Collagen IV抗体,二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体。3.荧光染色1、4、8、12周负压吸引后的样品被石蜡包埋后,切片为3微米玻片,其后进行免疫荧光染色,一抗过夜。实验所用一抗为Ki67,Perilipin抗体。核染色为亲核染料4’,6-二脒基-2-苯基吲哚染色。一抗孵育后,加488nm山羊抗兔荧光二抗。染色结束封片后,用蔡司激光共聚焦显微镜拍摄。4.脂肪来源干细胞分离及培养实验用3周龄SD大鼠取腹股沟区皮下脂肪组织。首先进行物理剪切成10微米大脂肪组织颗粒,加入一型胶原酶消化30分钟。待组织彻底消化后加入完全培养基终止消化,离心,取上清后取沉淀。重新悬浮细胞后,接种于含有6ml完全培养基(DMEM培养液、10%胎牛血清、1%盘尼西林)的100mm培养皿中。48小时后,将未贴壁的细胞PBS冲洗3遍并移除,其后加入新鲜的完全培养基进行后续细胞培养。后期细胞培养阶段,每2-3天更换培养基一次,将贴壁的形状称长梭形细胞、原代传代3次后的细胞定义为脂肪来源干细胞,其后可进行试验运用。5.脂肪组织脱细胞处理脂肪组织脱细胞方式根据已报道文献标准方式处理。简要来说经历5天去垢剂脱细胞流程。经历物理匀浆充分对脂肪组织破碎,其后进行一小时-80℃到37℃反复冻融,运用极性萃取剂异丙醇萃取,然后运用胰酶消化及核酸酶充分去除细胞成分。最终将处理好的脂肪组织脱细胞基质放置于无菌PBS中4℃储存,待后检测及细胞种植检测。6.脂肪来源干细胞种于脂肪脱细胞基质将5mg脱细胞后脂肪组织(DAT)放置于24孔板,加入PBS洗涤3次。其后移除PBS加入完全培养基放置于细胞培养箱进行细胞种植前预处理。待一天预处理后,将5×10^5第三代脂肪来源干细胞重新种植于脱细胞脂肪组织(DAT)上。重新种植48小时后将未贴的细胞去除,同时加入新的培养基。培养基每3天更换一次。培养3天后,检测细胞在DAT上增殖,成脂分化情况。7.油红O染色细胞种植于脂肪脱细胞基质(DAT)加入成脂诱导培基(DMEM、10%胎牛血清、1%盘尼西林、罗格列酮、胰岛素、IBMX、吲哚美辛)培养7天后,4%多聚甲醛固定后,加入油红O染料室温染色。8.统计分析数据均以均数±标准差表示,使用统计软件spss 21.0进行数据处理。单因素方差分析用于比较多时点的数据,独立t检验用于比较单个时点多组间数据。P<0.05被认为具有统计学意义。其中P<0.05表明统计具有显著统计学意义,*代表p<0.05,**代表p<0.01。结果1.HE染色脂肪组织形态学检测HE染色结果显示,负压吸引组脂肪组织形态学结构基本与对照组一致。在吸引组,40x放大倍数下可以观察到明显的纤维结缔组织样结构出现于脂肪组织中,200x放大倍数下明显观察到脂肪细胞间隙有胶原纤维样渗出。而对照组并未发现明显纤维渗出,200x倍数下,只可观察到脂肪细胞间隙连接较为紧密并未发现明显纤维渗出。2.马松染色检测马松染色结果显示,在1、4、8、12周负压吸引组中,均可观察到明显胶原渗出存在于组织间隙,而对照组仅表现为少量阳性染色存在。进一步观察发现,阳性区域中,渗出胶原内存在大量新生小体积脂肪细胞。3.渗出胶原成分免疫组化检测为了探究胶原渗出成分,运用免疫组化检测4类主要胶原成分:在吸引组中,纤连蛋白,层粘连蛋白,一型胶原及四型胶原。免疫组化结果表明,相对于一型胶原及四型胶原,纤连蛋白和层粘连蛋白表达趋势有明显变化。纤连蛋白表现为1、4周逐渐升高,在第4周达到高峰,随后急剧下降。而层粘连蛋白阳性表达从第4周开始缓慢增加,直至12周。4.细胞增殖及成脂检测为了探究脂肪组织新生,运用免疫荧光检测细胞增殖-Ki67,小体积脂肪细胞新生-perilipin。统计结果显示细胞增殖在1、4周明显表达增高,随后8、12周逐渐下降。而小体积脂肪细胞数量随着吸引逐渐上升,在8、12周达到峰值。同时我们检测细胞成脂分化表达基因过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARy)表达趋势,随着吸引时间增加逐渐升高。5.脂肪组织脱细胞基质(DAT)细胞重新种植检测脱细胞脂肪组织免疫荧光结果显示,1周吸引组DAT明显高表达纤连蛋白,12周吸引组DAT明显高表达层粘连蛋白。细胞重新种植后检测细胞增殖成脂,结果显示,1周组DAT促进细胞增殖,12周组DAT促进细胞增殖、成脂分化。结论1.外吸引扩张器装置可以促进细胞间胶原渗出2.渗出胶原促进小体积脂肪细胞新生3.渗出胶原成分早期以纤连蛋白为主,促进脂肪来源干细胞增殖4.渗出胶原成分晚期以层粘连蛋白为主,促进脂肪来源干细胞成脂分化