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目的：土槿皮乙酸(pseudodaric acid-B,PAB)是从我国的松科植物会钱松(PseudolarixKaempferi Gord)的根皮及近根皮中分离出来的二萜类化合物,为一种单体成分。土槿皮乙酸传统上是作为一种抗真菌药物,后来发现其具有抗生育、抗血管生成和抗肿瘤作用。研究证明PAB可以抑制胃癌、肺癌、肝癌、宫颈癌白血病等多种肿瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡,其作用机制可能与清除氧自由基,作用于细胞周期集细胞周期蛋白依赖性激酶,影响p53、Bcl-2家族、Caspase激活,影响与肿瘤发生密切相关的细胞信号传导通路等有关。虽然近年来,多项实验对PAB抗肿瘤的作用机制进行了一定的研究,而且土槿皮乙酸对肝癌细胞增殖和凋亡确实有影响,但尚未发现有关PAB对肝癌侵袭转移作用的报道,本实验将探讨研究土槿皮乙酸对人肝癌BEL-7402细胞株侵袭转移能力的影响。,以为进一步开发治疗肝癌的新药提供试验依据。
方法：
1.细胞培养：人肝癌细胞株BEL-7402由中国医科大学附属盛京医院传染科实验室惠赠,在含10％胎牛血清的RPMI1640培养液、饱和湿度,饱和温度为37℃,CO2浓度为5％的培养箱中培养。
2.MTT比色法检测细胞增殖：人肝癌细胞株BEL-7402细胞密度调整为5×104/L,接种于96孔培养板,每孔100μl。培养12小时后分别加入含不同浓度PAB的培养液,分别培养24,48,72h,应用MTT比色法检测各孔吸光度值(OD值),计算细胞生长抑制率。
3.Transwell检测PAB对BEL-7402细胞侵袭能力的影响：冰上1:10稀释过夜解冻的Matrigel胶并铺至Transwell小室内部的膜上。取指数生长期的细胞用于实验,打匀的细胞悬液加入Transwell小室,同时加入0.5μmol·L-1PAB,我选择的PAB浓度是用MTT筛选出的72h的IC50,以血清浓度差作为趋化条件,小室内为含1％血清的培养基,下室为含30％血清的培养基。常规培养24小时后予甲醇固定,姬姆萨染色,取膜,封片,镜检。细胞计数,倒置显微镜下随机选取5个视野(400*)计数细胞个数,取均数。
4.Transwell检测PAB对BEL-7402细胞迁移能力的影响：体外转移能力的测定时Transwell小室的滤膜不用Matrigel胶覆盖。方法同Transwell侵袭实验。
5.统计学方法：采用SPSS13.0统计软件,计量资料以(-X)±S表示,采用t检验。
结果：
1.PAB对BEL-7402细胞增殖的影响不同浓度PAB(0.5,1.0,2.0,4.0)作用相同时间,随着药物浓度的增加,对细胞生长的抑制率增加,相同浓度PAB作用不同时间(24,48,72h),随着时间的增加,对细胞生长的抑制率增加。表现出明显的剂量依赖性和时间依赖性(P＜0.05),0.5μmol·L-1PAB作用24小时,对细胞生长无显著影响。
2.PAB对BEL-7402细胞侵袭迁移能力的影响PAB组迁移与侵袭细胞数明显低于对照组,对照组细胞轮廓清晰,活力旺盛,PAB组细胞明显变圆,稀疏。PAB组迁移与侵袭能力较对照组下降,差别具有统计学意义(P＜0.05)。提示PAB对于肝癌BEL-7402细胞的迁移能力有明显的抑制作用。
结论：土槿皮乙酸作用后肝癌细胞粘附率较对照组明显下降(p＜0.05),呈时间和浓度依赖性,土槿皮乙酸作用后肝癌细胞侵袭转移细胞数较对照组明显下降(p＜0.05)。研究结果表明土槿皮乙酸能抑制肝癌细胞增殖,降低肝癌细胞侵袭迁移能力。