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目的:广泛软组织损伤在法医学实践中较为常见。当肢体受到打击或挤压作用后,不仅肢体局部组织出现严重损伤,而且常常引起机体远隔器官如肾脏、肺脏、肝脏的严重功能障碍、多器官功能不全综合征(MODS)乃至机体死亡。本室以往的研究发现,挤压大鼠双后肢可导致远隔器官如肝脏、肾脏、肺脏等功能障碍,同时肺脏、肝脏以及挤压的局部肌组织中诱生型一氧化氮合酶(iNOS)表达上调、NO生成增加,NO参与介导肢体挤压伤引起的肝脏和肺脏损伤,然而NO的作用机制尚未完全阐明。有报道,NO通过诱导细胞凋亡增多而参与介导器官损伤。细胞凋亡是一个程序化的过程,Caspase蛋白酶、Bcl-2基因家族、Ced基因、p53、Fas和Fas-L等多种因素参与调控细胞凋亡。迄今为止,肢体挤压伤导致远隔器官细胞凋亡的发生规律、NO参与介导远隔‘器官的细胞凋亡及其作用机制尚不清楚。本实验拟在复制挤压大鼠双后肢致远隔器官损伤的基础上,使用NOS抑制剂和底物调节大鼠NO生成量,观察肺脏和肝脏的细胞凋亡变化及Bcl-2、Bax、Caspase-3等凋亡相关蛋白的表达,以探讨NO的作用机制。
方法:实验分为(1)对照组(S组),(2)挤压组(C组),(3)挤压加氨基胍组(A组),(4)挤压加L-精氨酸组(L组)。制备挤压组(C)大鼠模型,连续挤压大鼠双后肢5h后,释放大鼠,观察5h后,经腹主动脉快速放血处死,收集检材待检。S组除不挤压外,其余处理同挤压模型。A组在挤压5h松开时舌下静脉注入氨基胍10mg/kg。L组在挤压5h松开时舌下静脉注入L-精氨酸150mg/kg。留取肺脏、肝脏组织适量,常规制作石蜡组织切片,用原位末端标记法(TUNEL)检测肺脏和肝脏的细胞凋亡变化,用免疫组化方法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表达,并观察组织病理学变化。用SPSS13.0统计分析软件进行统计学分析,数据用x±s表示,各组均数的比较行单因素方差分析(one-way ANOVA),用最小显著差异法(least significant difference,LSD)作两两比较,P<0.05为有显著性差异。
结果:1.挤压大鼠双后肢诱导肺脏和肝脏的细胞凋亡增多在肺脏,细胞凋亡主要分布于支气管粘膜上皮、血管内皮细胞;与S组相比,C组细胞凋亡指数明显增加(P<0.01);与C组比较,L组凋亡细胞指数明显增高(P<0.05),A组凋亡细胞指数明显降低(P<0.05)。在肝脏,细胞凋亡主要分布在血管内皮细胞;与S组相比,C组细胞凋亡指数明显增加(P<0.01);与C组比较,L组凋亡细胞指数明显增高(P<0.05),A组凋亡细胞指数明显降低(P<0.05)。
2.挤压大鼠双后肢诱导肺脏和肝脏的Bcl-2蛋白表达变化在肺脏,Bcl-2蛋白阳性信号主要分布在支气管粘膜、肺血管内皮细胞;与S组比较,C组阳性信号明显降低(P<0.01);与C组比较,L组阳性信号明显降低(P<0.05),A组阳性信号强度明显增高(P<0.05)。在肝脏,Bcl-2蛋白阳性信号主要分布于肝窦内皮细胞;与S组比较,C组阳性信号强度明显降低(P<0.01);与C组比较,A组阳性信号强度明显增高(P<0.05),L组阳性信号强度明显降低(P<0.05)。
3.挤压大鼠双后肢诱导肺脏和肝脏的Bax蛋白表达变化在肺脏,Bax蛋白阳性信号主要分布于肺支气管粘膜和肺血管内皮细胞;在肝脏,Bax蛋白阳性信号主要分布于肝窦内皮细胞;各组Bax蛋白阳性信号在肺脏、肝脏中的表达呈现一致性变化,即在S组Bax蛋白阳性信号处于较低水平;与S组比较,C组阳性信号明显增高(P<0.01);与C组比较,A组阳性信号明显降低(P<0.05),L组阳性信号明显增高(P<0.05)。
4.挤压大鼠双后肢诱导肺脏和肝脏的Caspase-3蛋白表达变化在肺脏,Caspase-3蛋白阳性信号主要分布于支气管粘膜和肺血管内皮细胞;在肝脏主要分布于肝窦内皮细胞;各组Caspase-3蛋白阳性信号在肺脏、肝脏中的表达呈现一致性变化,即在S组Caspase-3蛋白阳性信号处于较低水平;与S组比较,C组阳性信号明显增高(P<0.01):与C组比较,A组阳性信号明显降低(P<0.05),L组阳性信号明显增高(P<0.05)。
结论:挤压大鼠双后肢可诱导远隔器官肺脏和肝脏的细胞凋亡增多;NO参与介导了挤压大鼠后肢诱导的肺脏和肝脏的细胞凋亡的增多,其中,NO的作用可能是通过调节Bcl-2、Bax和Caspase-3来实现的。