表观遗传学是在基因DNA序列不发生改变的情况下,研究可遗传的基因表达的一门学科。所研究对象是染色质的DNA和组蛋白化学修饰,例如组蛋白乙酰化、DNA甲基化等。它们相互作用维持机体内环境的稳定,控制细胞表型;其修饰异常会导致肿瘤和自身免疫性疾病等各种疾患的发生。BRD4含有两个溴结构域和一个超末端结构,是表观遗传修饰的阅读蛋白质。在整个细胞周期中,其溴结构域识别乙酰化的组蛋白,在高乙酰化和转录活跃的染色质区域聚集(包括启动子和增强子)招募不同的转录因子,如介导蛋白Mediator和P-TEFb形成蛋白质复合物组装的成核中心,促进RNA Pol II的活性,刺激基因转录的起始和延伸,从而调控细胞的生长和分化。BRD4的表达异常与急性髓细胞性白血病、黑色素瘤、伯基特淋巴瘤、结肠癌、多发性骨髓瘤、NUT中线癌和乳腺癌等多种肿瘤的发生发展密切相关;通过小分子靶向抑制BRD4,能诱发肿瘤细胞凋亡及增殖减缓,从而达到抗肿瘤的作用,因此,BRD4作为抗癌药物研发的重要靶标被广泛认可。但其具体的作用机制我们仍然不清楚。在细胞中存在许多无膜的细胞器样结构,这些结构包含蛋白质,核酸等生物功能分子,能够在局部形成高密度,高浓度的相位分离的液滴样结构,并且能够与外界发生物质交换。研究表明,含有固有无序结构的蛋白质更容易发生相位分离。BRD4的N末端氨基酸序列存在大量的低复杂性的固有无序区域,包括富集苏氨酸、丝氨酸残基的NPS和CPS结构域,和赖氨酸的BID结构域等。因此,我们希望通过液态相位分离了解BRD4蛋白在调节基因转录过程中分子机制,为癌症的治疗寻找一种新的治疗途径。首先,我们将不同截短体的BRD4蛋白与DNA结合,发现BRD4可通过有序结构和无序区域与DNA结合,这种作用与DNA的核苷酸序列无关;BRD4结合DNA的关键氨基酸序列是N末端的不同的IDRs区域。CK2磷酸化的BRD4蛋白降低了结合DNA的能力。而且加入BRD4小分子抑制剂,不影响BRD4S与DNA的结合,说明BRD4溴域上的乙酰化赖氨酸结合口袋与DNA未见直接的作用影响。其次,在体外和细胞内都观察到BRD4S形成具有液态相分离特征的核斑点。且通过1,6-己二醇、高盐浓度和小分子抑制剂JQ1处理细胞,发现BRD4核斑点数量减少及荧光强度减弱,说明了核斑点的液态相分离特性。最后,在C33A细胞中瞬时转染带Flag标签的BRD4S质粒,检测BRD4S的蛋白水平和相关基因的mRNA水平,结果显示BRD4S的蛋白水平随着转染量的增加而增加,p21,CDK6,PMSD5等基因的转录水平也随之升高。这些数据表明,BRD4蛋白通过无序和有序结构域溴域双共价作用于乙酰化组蛋白和DNA,促进其在染色质上定位。BRD4蛋白N末端的IDRs无序结构域能促进BRD4与DNA的相互作用,控制在体外以及细胞内的液态相分离的形成,招募基因转录机器蛋白质组件聚集到染色质上,进而调控基因的转录和癌细胞的增殖。因此,我们的研究为探究BRD4在肿瘤细胞中的基因转录调控机制提供了新的研究思路,为筛选优化BRD4创新型小分子抗癌抑制剂揭示了新的作用机制。