背景动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是一个严重危害人类健康的疾病,其发病机制一直以来成为研究者关注的焦点。目前研究常见的动物模型有鼠、家兔、禽类、猪、食肉类(犬,猫)和非人灵长类等AS动物模型。狒狒是灵长类动物之一,其基因学,解剖学和病理生理学与人类相近,是研究AS较为理想的实验动物。内皮细胞损伤是AS发生发展中的起始和关键环节。本实验选用原代狒狒股动脉内皮细胞(Baboon Femoral Arterial Endothelial Cell, BAEC)进行体外实验,模拟炎症因子对体内大血管早期损伤的机制。目前许多研究证实炎症因子对内皮细胞毒性损伤在心血管疾病的发病机制中发挥重要的作用。在病理条件下,炎症介质可以损伤内皮的屏障功能,导致通透性增高,表面粘附因子表达增加,单核细胞粘附聚集和泡沫细胞的形成,从而造成血管功能障碍,进而导致大血管动脉粥样硬化。肿瘤坏死因子-α (TNF-α)是一个明确的心血管风险因子和炎症因子,可通过损伤血管内皮细胞,促进单核细胞对内皮细胞的粘附,参与AS发生、发展过程。临床研究发现它富集于动脉粥样硬化的病变处,不存在于正常的组织中,成为其参与动脉粥样硬化炎症反应的直接证据。白藜芦醇(Resveratrol, RSV)是一种生物性较强的天然多酚类物质,又称芪三酚。天然RSV广泛存在于花生、葡萄和虎杖等植物中。流行病学研究显示高脂饮食的法国人群冠心病发病率较低,归因于红酒中的白藜芦醇成分,具有抗氧化,抗炎,调脂等心血管保护作用和防治动脉粥样硬化的作用,但具体作用机制尚需进一步探索。目前研究显示RSV对人动静脉内皮细胞具有抑制或促进生长的作用,存在明显争议。本研究选择了不同剂量的白藜芦醇,研究其对炎症损伤状态下的原代BAEC的作用特点,进一步探讨RSV保护血管的可能机制。材料和方法1.细胞培养消化狒狒股动脉,获得原代股内皮细胞(BAEC),悬浮于20%FCS-F-12K培养基,接种于铺有明胶的6孔板上。每三天全量换液,细胞长至85-95%可传代或冻存。2.CD31+免疫磁珠标记内皮细胞选用CD31+免疫磁珠标记内皮细胞,从而筛选、纯化原代分离的股动脉内皮细胞。3.内皮细胞功能和细胞骨架测定免疫荧光染色法简述如下：固定,封闭,一抗孵育,冲洗,二抗孵育,DAPI染色,封片,荧光显微镜下观察。Dil-LDL/UEA-1、vWF和VE-cadherin特异性标记内皮细胞,F-actin和β-tubulin非特异性染色细胞骨架,α-actin为肌纤维细胞的相对特异性染色。4.内皮细胞胞增殖实验选用MTT法测定内皮细胞的增殖。观察不同剂量的白藜芦醇(RSV,0.1-100μmol/L)和或TNF-α (lOng/ml)对内皮细胞增殖的影响。5.流式细胞技术测定内皮细胞表面粘附因子本实验选用适合于狒狒的抗体为：抗人E-选择素-FITC(R&D Systems公司,#1C0025),抗人VCAM-1-PE (US Biological公司,#400122),抗人ICAM-1-APC (BD Biosciences公司,#555749)。观察TNF-α (10ng/ml)和或不同剂量的白藜芦醇(RSV,0.1-100μmol/L)对内皮细胞表面粘附因子表达的影响。6.细胞因子测定ELISA法测定内皮细胞分泌的单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和白介素-1β(IL-1β)因子。7.内皮细胞炎症损伤测定划痕实验法测定内皮细胞迁移愈合能力。管腔形成实验测定内皮细胞血管形成的能力结果1.狒狒股动脉内皮细胞形态和功能鉴定原代狒狒股动脉内皮细胞(baboon femoral arterial endothelial cells, BAECs),早期(Figl. A, day3)呈小多角、球形、呈团状,48-72h生长最快,逐渐生长成梭形,有些细胞排列呈鱼贯状相连,间有旋祸状排列。7-10天胞体呈多角形,相互嵌合,为单层呈铺路石状排列(Figl.B,day7)。培养基为20%FCS-F-12K,每三天全量换液,约7-10天,可传代。狒狒肱动脉纤维细胞呈长梭形,生长迅速,与内皮细胞形态差别显著(Figl. C)。镜下观察收集的内皮细胞纯度通常>85%(Figl. B),有时收集到纯度<50%的内皮细胞(Figl. D),可见混杂的纤维细胞。VE-Cadherin (Fig2.A)和vWF (Fig2. B)为狒狒股动脉内皮细胞特异性染色。F-肌动蛋白(F-actin, Fig2. C)和β-微管蛋白(β-tubulin, Fig2. D)为BAEC非特异性骨架染色,可见内皮细胞骨架结构完整。α-肌动蛋白(α-actin, Fig2. E)和p-微管蛋白(β-tubulin,Fig2. F)为纤维细胞骨架染色,其中α-肌动蛋白不能染色内皮细胞。CD31+免疫磁珠标记内皮细胞(Fig3.A,B),金黄色磁珠附着于内皮细胞表面,随传代逐渐脱落,密度减少,不影响内皮细胞生长和功能。内皮细胞Dil-LDL/UEA染色双阳性。2.肿瘤坏死因子-α (TNF-α, lOng/ml)激活内皮细胞TNF-α激活的内皮细胞高表达ICAM-1, VCAM-1, E-selectin和分泌MCP-1和IL-1β。同时TNF-α能抑制内皮细胞的增殖,延缓内皮细胞划痕愈合速率。3.白藜芦醇对内皮细胞的保护作用小剂量(0.1,1μmol/L)白藜芦醇对内皮细胞生长无明显影响。10-100μmol/L白藜芦醇能明显促进狒狒股动脉内皮细胞的增殖,并且能减轻肿瘤坏死因子-α(TNF-α, lOng/ml)对内皮细胞的损伤作用,但不能逆转炎症损伤。白藜芦醇10μmol/L能明显促进内皮细胞的划痕愈合速率。白藜芦醇(1,10,50μmol/L)能明显减轻肿瘤坏死因子-β (TNF-α,10ng/ml)对内皮细胞划痕愈合速率的损伤,但不能逆转损伤。白藜芦醇(10,50μmol/L)和TNF-a (lOng/ml)共孵育24小时后,能明显抑制VCAM-1和ICAM-1的表达,可能是通过抑制NF-KB信号通路实现的。结论1.狒狒原代股动脉内皮细胞具有结构完整,高纯度和高生物活性特点,且狒狒便于活检取大血管,为深入研究动脉粥样硬化机制提供了理想的动物模型。2.肿瘤坏死因子-α (TNF-α)损伤狒狒股动脉内皮细胞,促进动脉粥样硬化的发生发展。3.白藜芦醇(RSV)能抑制TNF-α对内皮细胞的损伤,具有明显的抗炎和抗动脉粥样硬化作用。背景近30年来发现,低密度脂蛋白的氧化修饰在动脉粥样硬化(AS)发生机制中起着重要的作用(1,2)。有学者发现人、兔动脉粥样硬化斑块处分离出的LDL的特性与Ox-LDL相似,包括电泳速度加快、ApoB降解等,而正常动脉壁处LDL无此特性。Ox-LDL刺激内皮细胞分泌粘附分子(E-selectin、ICAM-1、VCAM-1),诱导单核细胞分化为巨噬细胞并分泌特异的针对单核细胞的趋化剂(MCP-1)。进而,巨噬细胞通过清道夫受体聚积OxLDL,转变为泡沫细胞。目前低密度脂蛋白颗粒浓度和脂肪酸组成成分都不能被证实具有直接促动脉粥样硬化作用,并且不同的研究者得出了大量的LDL促动脉粥样硬化和抗动脉粥样硬化的结论(6),因此低密度脂蛋白在动脉粥样硬化发生发展中的具体作用机制尚存在争议。目前研究常见的动物模型有鼠、家兔、禽类、猪和食肉类(犬,猫)等AS动物模型。因不同AS动物模型对高脂饮食敏感性不一,血脂基线水平不同,发病时间、发病部位及斑块特点与人类存在不同程度的差异性,研究结论各有差异,因此选用合理的动物模型显得尤为重要。狒狒是灵长类动物之一,其基因学,解剖学和病理生理学与人类相近,是研究AS较为理想的实验动物。特别重要的是,狒狒和人的低密度脂蛋白极其相似(18),因为蛋白和脂肪在形成氧化低密度脂蛋白时经历了复杂的氧化过程(6,16,17)。狒狒为我们提供了极为宝贵的机会深入研究低密度脂蛋白在AS形成发展中的机制。AS主要侵犯大动脉和中等动脉,如主动脉、冠状动脉和脑动脉。血管内皮损伤为AS发生发展中始动环节。有些研究显示,低密度脂蛋白或氧化的低密度脂蛋白能造成内皮细胞凋亡(11,12),也有研究显示这些物质具有促生长作用(13,14)。本研究选用了狒狒原代股动脉内皮细胞,同时改进了低密度脂蛋白的制备,研究低密度脂蛋白单独以及与单核细胞共培养是否损伤大血管内皮细胞及可能机制。材料和方法1.1低密度脂蛋白的分离、氧化和特点血浆库来源于7只狒狒的新鲜血液。超速离心技术分离出血中的低密度脂蛋白(LDL)。加入0.1mM抗氧化剂二丁基羟基甲苯,可获得天然LDL(Na-LDL)。加入新配置的5μM的CuSO4,37℃孵育LDL6小时,制备过氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)。加入无CuSO4的PBS液,37℃孵育LDL6小时,制备微氧化低密度脂蛋白(mm-LDL)。Lowry法根据总蛋白含量衡量分离的LDL的浓度。TBARS蛋白浓度衡量LDL的氧化程度。2%琼脂糖凝胶电泳相对迁移率测定不同氧化程度的LDL相对电泳迁移率(REM)的变化。相对电泳迁移率=氧化的LDL/未氧化的LDL。1.2狒狒股动脉内皮细胞和单核细胞的分离及培养狒狒股动脉内皮细胞分离和培养方法同第一部分。Ficoll (1.077)密度梯度离心法获取外周血单核细胞(PBMNCs),孵育过夜,去上清,贴壁细胞即为单核细胞。抗CD14-FITC和抗CD36-FITC孵育流式细胞仪鉴定单核细胞,DIL-LDL和UEA-1染色来测定单核细胞的功能。1.3不同氧化程度的LDL对内皮细胞的作用特点1.3.1内皮细胞生长和凋亡的测定浓度为50μg/mL和100μg/mL的天然LDL、微氧化LDL和过氧化LDL单独孵育股动脉内皮细胞24h。Lowry法和Annexin V染色法观察内皮细胞的生长和凋亡。1.3.2内皮细胞表面粘附因子的测定100μg/mL天然LDL、微氧化LDL和过氧化LDL单独孵育股动脉内皮细胞4h和24h。或天然LDL (50μg/mL和100μg/mL)与单核细胞共孵育内皮细胞4小时。流式细胞技术测定内皮细胞表面粘附因子的表达。1.4单核细胞的活化浓度为50和100μg/ml的天然LDL分别刺激单核细胞0,0.5,1,4,8,12,24小时,取细胞上清液。ELISA法测TNF-α和IL-1p的含量。500ng/ml的LPS作为阳性对照。1.5天然LDL和单核细胞的共培养体系共培养小室(8.0μm,德国)置于12孔板上,小室上层为单核细胞,培养基为单核细胞培养液。12孔板内为BAECs (0.5-1X106/孔),培养基为0.5m12%FCS-F-12K溶液。小室上层加入50μg/ml或100μg/ml的天然LDL,等量PBS和TNF-α作为空白对照和阳性对照。天然LDL (50μg/mL)单独或和单核细胞共培养24小时。流式细胞技术测定内皮细胞表面粘附因子的表达1.6抗体中和试验测定内皮细胞表面粘附因子单核细胞培养基中加入100μg/mL天然LDL,24小时后收集培养基为条件培养液。并将其分为两组：中和组加入10μg/mL山羊抗人TNF-α和10μg/mL抗人IL-1βIgG,对照组加入等量的非特异性山羊IgG,置于C02培养箱中37℃培养4小时,将两组液体孵育内皮细胞4小时。流式细胞技术测定E-选择素,ICAM-1和VCAM-1的表达。结果1.低密度脂蛋白制备特点天然低密度脂蛋白中TBARS浓度为0-2nmol/mg蛋白,过氧化低密度脂蛋白(ox-LDL) TBARS浓度为160-200nmol/mg蛋白。与微氧化(mm-LDL)和天然低密度脂蛋白(Na-LDL)相比,过氧化低密度脂蛋白有较高的电泳迁移率。微氧化低密度脂蛋白显示出弥散的电泳带。2.低密度脂蛋白对狒狒内皮细胞生长和凋亡的作用Lowry法结果显示,低浓度(50μg/mL) Na-LDL对人HAEC和三只狒狒的股动脉内皮细胞生长无影响,高浓度(100μg/mL)孵育24小时可以造成编号为1x8000的狒狒来源的股动脉内皮细胞的明显损伤,对人HAEC和另外两只狒狒的BAEC无影响。浓度为50和100μg/ml的mm-LDL,对BAEC和HAEC24小时无直接损伤。100μg/ml ox-LDL能显著损伤人HAEC细胞生长,且实验组7只狒狒中,5只狒狒的股动脉内皮细胞有明显的损伤。细胞形态学变化及Annexin V测定也证实,ox-LDL具有明显的内皮细胞损伤作用,Na-LDL和mm-LDL对股动脉内皮细胞无明显的直接损伤作用。3.LDL对内皮细胞粘附因子表达的影响与TNF-α相比,不同氧化程度的LDL单独孵育不能有效的刺激BAECs表面粘附分子(CAM)的表达。Ox-LDL可轻度升高部分狒狒的CAM,可能存在基因敏感差异性。4.天然LDL对单核细胞的活化Na-LDL增加单核细胞分泌TNF-α和IL-1β,呈剂量和时间依赖性,并与单核细胞结合,明显降低单核细胞CD36的表达水平。5.LDL和单核细胞共培养对内皮细胞粘附因子表达的影响天然LDL (50μg/mL,100μg/mL)和单核细胞共培养孵育内皮细胞4小时,可强烈刺激内皮细胞表达E-选择素,细胞间粘附分子-1(VCAM-1)和血管细胞粘附分子-1(ICAM-1)。5.抗体中和试验测定内皮细胞表面粘附因子Na-LDL与单核细胞共培养可强烈刺激内皮细胞CAM,而这种协同激活作用能够被人抗TNF-α和IL-1βIgG中和抵消。结论1.首次制备了同一来源、不同氧化程度的LDL,各具特点和活性。2. Na-LDL和mm-LDL对人和狒狒大血管内皮细胞均无直接的损伤作用。研究提示LDL对内皮细胞的损伤取决于其氧化程度,不是激活内皮细胞表达CAM的有效刺激物。3. Na-LDL能够激活单核细胞分泌炎症因子TNF-α和IL-1β,共培养介导内皮细胞损伤。抗TNF-α和IL-1β抗体可抑制此协同作用。4.狒狒来源的股动脉内皮细胞对炎症刺激反应存在差异性,其基因差异性发挥重要的作用。