青蛤(Cyclina sinensis)是我国重要的海产经济动物。近年来,随着我国沿海环境污染日趋恶化,重金属污染现象不断扩大并且制约着养殖业的健康发展,由此引发的贝类食品安全问题受到了全社会的普遍关注。从现有的国内外相关文献资料检索看来,有关重金属在青蛤体内蓄积及毒害方面的研究已有一些报道,但有关重金属胁迫下青蛤的分子免疫防御机制方面尚没有正式报道。本研究从青蛤抵御重金属镉Cd2+的逆境应激反应入手,在检测了镉胁迫下青蛤免疫相关酶系活性的基础上,利用SMART方法构建了青蛤的cDNA文库,采用EST高通量测序和生物信息学分析方法,筛选重金属胁迫下青蛤免疫相关因子基因的表达序列。分析得到了青蛤的金属硫蛋白和硫氧还蛋白基因的全长cDNA序列,在对两种免疫因子基因的序列特征、蛋白质空间结构、信号识别方式和代谢途径等分析后,进一步利用RT-PCR方法检测了两种免疫相关因子mRNA在不同组织中时序表达水平,为揭示青蛤抗重金属胁迫反应的分子机制和免疫调控路径提供了有价值的理论基础和实验数据。本研究在青蛤暂养条件下建立了实验组和对照组,分别对镉Cd2+胁迫下实验组青蛤的不同组织中超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT和谷胱甘肽过氧化物酶GPx等氧化酶系的活性进行了时序检测。实验结果显示：SOD、CAT、三种酶的整体活性变化趋势基本一致；在肝脏和血清中均为呈现先升后降。实验组血清中SOD活性在12h时达到峰值；实验组肝脏中SOD活性在24h时达到峰值；两者与对照组均出现显著性差异(P<0.05)。随着时间的延长,酶活逐渐下降,但96h时其活性均与对照组差异显著(P<0.05)。实验组血清及肝脏中CAT活性均在12h时达到最大,且均与对照组差异极显著(P<0.01)；之后酶活随时间延长而下降。实验组血清中GPx活性在24h时达到峰值,且12h和24h与对照组差异极显著(P<0.01)；实验组肝脏中GPx活性在12h时达到峰值,对照组差异显著(P<0.05),而在96h其活性显著低于对照组。结果初步证明重金属镉能够诱导三种氧化酶的活性上升,而胁迫时间超过一定范围后,三种酶活性均会逐步下降。研究者进一步构建了青蛤的SMART-cDNA文库,通过对表达的EST序列的高通量测序及生物信息学分析后,筛选出青蛤的金属硫蛋白及硫氧还蛋白cDNA的全长序列。结果发现,青蛤的金属硫蛋白和硫氧还蛋白的cDNA全长分别为776bp和804bp,金属硫蛋白基因开放阅读框长度为225bp,可以编码74个氨基酸,包含7个CXC特征结构,具有完整的金属硫蛋白结构域,其理论分子量为7.18kD,理论等电点为7.85。硫氧还蛋白基因开放阅读框长度为498bp,编码165氨基酸,含有典型的硫氧还蛋白结构域,且具有由5个氨基酸残基(Trp-Cys-Gly-Pro-Cys)构成的活性部位,其理论分子量为18.75kD,理论等电点为8.65；对青蛤Trx空间结构预测发现,其蛋白质高级结构与菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum) Trx高级结构相似。金属硫蛋白及硫氧还蛋白基因在GenBank上获得的注册号分别为HM246244和JN969050。本研究还利用了实时荧光定量RT-PCR方法,分别检测了青蛤血液组织中金属硫蛋白MTs和硫氧还蛋白Trx基因在Cd2+胁迫下的mRNA的时序表达特征。实验结果显示,金属硫蛋白基因在Cd2+胁迫下6—12h时mRNA表达量明显上升,与对照组有显著性差异(P<0.01),24h后开始下降并趋于正常水平。硫氧还蛋白基因在Cd2+胁迫下mRNA在6h升高,在6—24h与对照组出现显著性差异(P<0.05),并且持续时间较长。结果认为Cd2+能够诱导青蛤金属硫蛋白和硫氧还蛋白基因表达的时序性升高,二者的转录过程反映了贝类抵御重金属胁迫的分子调控过程,并且在一定程度上说明金属硫蛋白及硫氧还蛋白基因的表达特性。综合分析后认为,重金属镉对青蛤免疫应激反应有显著影响,其侵染青蛤后会诱导抗氧化酶系的活性明显升高。其中,青蛤血清和肝脏中的SOD、CAT和GPx活力对Cd2+胁迫敏感度最强,因此,青蛤这些组织的抗氧化酶系活性变化可以作为水体重金属污染监测的一种生物学指标。镉Cd2+侵染后能够引起青蛤免疫抗重金属相关因子基因的超量表达,包括金属硫蛋白和硫氧还蛋白mRNA的大规模转录,并且其基因的表达水平在短期内随胁迫时间的增加而上升,说明金属硫蛋白和硫氧还蛋白在青蛤抵抗重金属逆境中发挥重要作用。另外,通过两种免疫蛋白的氨基酸序列与其它动物相关序列比对后发现,青蛤的金属硫蛋白和硫氧还蛋白在进化上比较近于脊椎动物的同源蛋白质。