研究背景前列腺癌(Prostate Cancer, Pca)是发生于前列腺上皮的恶性肿瘤,是老年男性常见的恶性肿瘤。在世界范围内,前列腺癌发病率位于男性所有恶性肿瘤的第二位,死亡率居第六位,严重威胁人类生命健康。既往我国前列腺癌发病率相对较低,但随着人口老龄化的加剧,生活环境的污染,饮食生活习惯的改变以及前列腺特异抗原筛查的逐步推广,近年来其发病率逐渐增高。根据不同的病情,前列腺癌的治疗方式包括主动监测,根治性手术治疗,外放射治疗(External Beam Radiotherapy, EBRT),近距离照射治疗,试验性前列腺癌局部治疗及内分泌治疗等。目前内分泌治疗是治疗早期前列腺癌的标准手段之一,然而在临床中发现,大多数患者经内分泌治疗一段时间后便进而发展为去势抵抗性前列腺癌(Castrate-resistant Prostate Cancer, CRPC)表现出对雄激素阻断不敏感,肿瘤恶性程度高。对于去势抵抗性前列腺癌可采用化疗。目前以Docetaxel(多西他赛)为基础的化疗已成为此类患者标准的一线化疗方案,但大部分的化疗药物都表现出毒副作用较大,选择性差或多药耐药等缺陷。近来,醋酸阿比特龙等新兴药物被证明对晚期前列腺癌有一定疗效,但是这些药物有效率不高,且高昂的花费在一定程度限制了其在我国的临床应用。Sipuleucel-T (Provenge)是世界上第一种有效的治疗去势抵抗性前列腺癌的肿瘤疫苗,但同样面临上述治疗费用性价比的问题,因此有必要继续研发一些安全、有效且花费较低的药物用于治疗前列腺癌。目前,在开发抗肿瘤新药方面,从天然植物中提取有效抗癌成分己经成为一个重要研究方向。在抗肿瘤天然药物的开发中,生物碱属于目前研究较多的一个分支。生物碱是一类含氮的碱性有机化合物,有类似碱的化学性质,主要存在于自然界的动植物中。大多数生物碱有复杂的环状结构,环内多包含有氮元素,以此为基础的结构表现出丰富的生理药理活性。目前已探明的生物碱约有2000种左右,在生物医学领域,把生物碱按照化学结构分为七种类型,依次为吡啶类和哌啶类,有机胺类,吲哚类,莨菪烷类,甾体类,异喹啉类,萜类。石蒜碱属于异喹啉类生物碱,为吡咯并菲啶的衍生物。石蒜碱是从石蒜科植物中分离得到的第一个生物碱,也是该科植物中最普遍的生物碱。石蒜碱具有多种生物药理活性,现有的研究证明,石蒜碱具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗疟疾、抑制乙酰胆碱酯酶活性、抑制维生素生物合成以及保护心血管等作用。近年来,石蒜碱丰富的药理、生理活性引起了生物医药研究领域的广泛关注,有关石蒜碱及其衍生物的抗肿瘤作用及机制研究方面的报道呈上升趋势。到目前为止,相当一部分研究已证明石蒜碱对肿瘤细胞的生长抑制作用显著高于其对正常细胞的生长抑制作用。石蒜碱对肿瘤的作用表现出广谱性,现有研究揭示了石蒜碱及其衍生物对白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、食道癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等肿瘤显示了不同程度的抑制作用。已有的研究揭示了石蒜碱抗肿瘤作用的复杂性,石蒜碱对前列腺癌细胞的杀伤作用是否存在其他机制尚未明确。因此有必要深入研究石蒜碱对前列腺癌细胞的影响,并探索可能存在的新机制。NF-kB是一种控制DNA转录、细胞因子产生和细胞存活的蛋白质复合物。NF-kB几乎存在于所有类型的动物细胞中并参与细胞对诸多刺激的响应,这些刺激包括应激、细胞因子、自由基、紫外线照射、氧化LDL及细菌或病毒抗原。在哺乳动物中,NF-kB家族由五个相关的转录因子：P50/NF-kB1、P52/NF-kB2、 REL/c-Re1、Rel-A/p65和Rel-B组成。这些转录因子均具有一个由300个氨基酸组成的N-末端DNA二聚域,称为Rel同源结构域(RHD)。通过RHD,NF-kB家庭成员可以形成同源和异源二聚体。RelA、c-Rel和RelB基因含有羧基端的转录激活域(TADS),这使他们能激活靶基因的表达。与此相反,p50和p52不含C-末端TADS;因此,p50和p52二聚体抑制转录,除非他们与含有TADS的蛋白质如RelA、c-Re1、RelB或BCL-3(一个转录相关共激活因子)结合。NF-kB的转录活性受到存在于细胞质中的IκB蛋白的抑制。目前有7个确定的IκB家庭成员,包括IkBα, IkBβ, Bcl-3, IkBε, IkBγ,以及前体蛋白P100和P105。当NF-kB与IκB结合时,因NF-kB不能入核而不具备转录活性。当IκB被磷酸化之后,NF-kB便可以解除IκB的抑制作用,进入细胞核,调节相关靶基因的转录。大量的细胞因子,致癌剂,和肿瘤微环境都能通过相应的信号通路活化NF-kB,从而调控下游蛋白的表达,参与肿瘤的发生,进展,侵袭,转移等。研究证实NF-kB在多种恶性肿瘤中处于异常激活状态,而抑制NF-kB的活性可抑制多种肿瘤的进展,提示NF-kB在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用。NF-kB信号通路和前列腺癌关系密切,多项研究表明,NF-kB在一系列前列腺癌细胞系和前列腺癌动物模型中持续激活,在缺乏雄激素受体表达的前列腺癌细胞系PC-3,DU145中发现NF-kB高度活化。凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs)是一类高度保守的内源性抗细胞凋亡因子家族,主要通过抑制Caspase活性和参与调解NF-kB的作用而抑制细胞凋亡。Survivin是IAP家族中的一个成员,具有抗细胞凋亡、调节细胞周期和参与血管生成的作用。Survivin在分化成熟的正常组织中(胸腺和生殖腺除外)几乎不表达,而在大多数常见的恶性肿瘤组织高表达。美国国立癌症研究中心对60种肿瘤细胞系进行检测,结果显示Survivin在60种肿瘤细胞系中普遍高表达,包括肾癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、结肠癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病等。由以上结论可见Survivin和泌尿系肿瘤关系密切,研究发现Survivin在不同的前列腺癌细胞株均有表达,表明Survivin在前列腺肿瘤的发生、发展中扮演一个重要的角色。研究还发现Survivin不仅在前列腺癌中高表达,而且与前列腺癌的临床分期、病理分级相关。综上所述,前列腺癌发病率呈逐年上升趋势,NF-kB信号通路是前列腺癌中的重要信号通路,.石蒜碱表现出良好的抗肿瘤活性,目前尚未有研究探讨盐酸石蒜碱(Lycorine Hydrochloride, LH)通过NF-kB信号通路及其下游Survivin对前列腺癌细胞的影响,所以我们认为有必要明确LH在前列腺癌细胞中的作用。本研究首先探讨了LH对前列腺癌细胞中NF-kB信号通路的影响,随后进一步探讨了LH对NF-kB信号通路下游靶标Survivin的作用,最后通过细胞增殖、周期、凋亡、肿瘤克隆形成、肿瘤细胞迁移、裸鼠皮下成瘤等实验分析LH对前列腺癌细胞表型的影响。本论文可分为以下三章。第一章盐酸石蒜碱抑制前列腺癌细胞NF-kB信号通路目的：盐酸石蒜碱在多种肿瘤中发挥抑癌的作用,但目前尚没有研究探索盐酸石蒜碱对前列腺癌细胞NF-kB信号通路的作用。本研究拟探索盐酸石蒜碱对前列腺癌细胞株PC-3和22Rv1细胞内NF-kB信号通路的影响。方法：分别用LH、BAY及LH+BAY作用于PC-3和22Rv1细胞48小时,用40ng/ml TNF-a刺激PC-3和22Rv1细胞株内NF-kB信号通路,提取作用0min和15min后细胞总蛋白,用Western Blot检测PC-3和22Rv1细胞内NF-kB信号通路相关蛋白P-KKα/β、IKKα/β、P-P65、P65、P-IkBα、IkBα的表达情况。结果：与DMSO组相比,LH、BAY及LH+BAY作用后,PC-3和22Rv1细胞中P-IKKα/β、P-P65、P-IκBa蛋白表达量明显下降。结论：盐酸石蒜碱可以有效抑制前列腺癌PC-3和22Rv1细胞株内NF-kB信号通路。第二章盐酸石蒜碱抑制前列腺癌细胞中Survivin表达目的：探讨盐酸石蒜碱作用后对前列腺癌细胞内NF-kB信号通路下游靶标survivin的影响。方法：用2μg/ml LH、5μM BAY、10nM YM-155、2μg/ml LH+5μMBAY、2μg/ml LH+lOnM YM-155、5μM BAY+lOnM YM-155、2μg/ml LH+5μM BAY+10nMYM-155作用于PC-3细胞48h后,分别提取细胞总RNA和总蛋白,分别采用qPCR, Western Blot和免疫荧光检测LH作用后对PC-3细胞内survivin mRNA及蛋白表达水平的影响。结果：与DMSO对照组相比,2μg/ml LH、5μM BAY、10nM YM-155、2μg/ml LH+5μM BAY、2μg/ml LH+10nM YM-155、5μM BAY+10nM YM-155、2μg/ml LH+5μM BAY+10nM YM-155处理后,PC-3细胞内survivin的表达在mRNA水平和蛋白水平均明显下降(P<0.05)。免疫荧光结果显示：DMSO作用后,survivin在前列腺癌PC-3细胞中呈强荧光着色；而与DMSO组相比较,2μg/ml LH、5μM BAY、10nM YM-155、2μg/ml LH+5μM BAY、2μg/ml LH+lOnM YM-155、5μM BAY+lOnM YM-155、2μg/ml LH+5μM BAY+lOnM YM-155处理后,PC-3细胞内荧光着色逐渐减弱。结论：盐酸石蒜碱可以有效抑制前列腺癌PC-3细胞株内NF-kB信号通路下游靶标survivin的活性,且这种抑制作用在和BAY、YM-155联和使用时具有协同效应。第三章盐酸石蒜碱对前列腺癌细胞表型的影响目的：探讨盐酸石蒜碱作用后对前列腺癌细胞株PC-3和22Rv1细胞生物学特性的影响。方法：以前列腺细胞株PC-3、22Rv1细胞为研究对象,实验处理组设为：①DMSO处理组；②LH处理组；③BAY处理组；④YM-155处理组；⑤LH+BAY联合处理组(L+B)；⑥LH+YM-155联合处理组(L+Y)；⑦BAY+YM-155联合处理组(B+Y)；⑧LH+BAY+YM-155联合处理组(L+B+Y)。分别作用于PC-3和22Rv1细胞24-48小时后,采用MTS研究LH对前列腺癌细胞体外增殖的影响；采用流式细胞计数研究LH对前列腺细胞凋亡和周期的影响；采用平板克隆形成实验研究LH对前列腺癌细胞体外克隆形成能力的影响；采用Transwell研究LH对前列腺癌细胞体外迁移能力的影响；同时建立裸鼠移植瘤模型,考察LH体内抗前列腺癌的作用。结果：1、LH在干预后2、3、4、5d后明显抑制PC-3和22Rv1细胞的增殖(P<0.05),其对PC-3和22Rv1细胞的增殖抑制程度与BAY和YM-155的抑制程度相当(P>0.05)。同时,LH与BAY或YM-155联用时,LH可加强BAY和YM-155对PC-3和22Rv1细胞增殖的抑制作用。2、LH对前列腺癌细胞凋亡的影响：LH可显著促进PC-3细胞及22Rv1细胞的凋亡(p<0.05)。其诱导PC-3和22Rv1细胞凋亡程度与BAY和YM-155相当(P>0.05)。但是LH与BAY和YM-155联用时可加强BAY和YM-155对PC-3和22Rv1细胞凋亡的促进作用。3、LH对前列腺癌细胞周期的影响：LH可显著降低PC-3和22Rv1 S期细胞的比例(p<0.05)。其效果与BAY和YM-155类似(P>0.05)。但LH与BAY和YM-155联用时,LH可显著加强BAY和YM-155对22Rv1 S期细胞比例的降低作用(p<0.05)。4、LH对前列腺癌细胞体外克隆形成能力的影响：与DMSO处理组相比,LH处理组的细胞克隆形成能力显著降低(p<0.05),而LH和BAY、YM-155处理组组间无差异(p>0.05)。同时,与单药处理组相比,两药联合或三药联合处理组明显降低PC-3和22Rv1细胞的克隆形成能力,表明LH可抑制前列腺癌细胞的体外克隆形成能力。5、LH对前列腺癌细胞体外迁移能力的影响：与对照组比较,2μg/ml LH、 5μM BAY、10nM YM-155、2μg/ml LH+5μM BAY、2μg/ml LH+10nM YM-155、 BAY+lOnM YM-155、2μg/ml LH+5μM BAY+10nM YM-155处理后PC-3细胞及22Rv1细胞穿过小室的数目均明显减少(p<0.05),同时与单药处理组相比,两药联合或三药联合处理组PC-3细胞穿过小室的数目均明显减少(p<0.05)。而LH、BAY和YM-155单药处理组组间无差异(P>0.05),L+B、L+Y和B+Y处理组组间无差异(p>0.05)。表明LH可抑制前列腺癌细胞的迁移能力,同时LH与BAY和YM-155联用时可获得对前列腺癌细胞迁移能力更强的抑制作用。6、LH对前列腺癌细胞皮下成瘤能力的影响：与PBS对照组相比,LH和YM-155均能显著抑制移植瘤的生长速度和肿瘤体积(p<0.05),而LH注射组和YM-155注射组组间无差异(p>0.05)。同时,与PBS对照组相比,LH和YM-155亦显著抑制了肿瘤的重量(p<0.05)。结论：LH可以通过抑制NF-κB及其下游靶标Survivin的作用方式,抑制前列腺癌细胞增殖,促进凋亡,阻滞细胞周期,降低细胞迁移能力,降低体内成瘤能力,并且这种抑制作用在LH和BAY、YM-155联和使用时具有协同效应。