【背景】呼吸心跳骤停病人实施心肺复苏后的死亡率高达近70%,其中最主要的死亡原因是中枢神经损伤。并且在存活的病人中有近2/3在心跳骤停发生3个月后出现中到重度的认知功能障碍,给患者及家庭带来沉重打击,也给社会造成非常大的经济负担。因此,在复苏的同时或者复苏后针对脑损伤进行预防和治疗变得尤为重要。线粒体作为细胞的能量工厂,参与细胞内Ca2+稳态调节、氧化应激反应、凋亡等生理过程。脑缺血再灌注损伤后,线粒体更是在多个环节参与神经损伤,表明线粒体是脑缺血再灌注所致神经元损伤的重要机制之一,是有望进行临床转化的脑缺血再灌注损伤治疗的新靶点,但目前仍然缺乏对线粒体安全有效的干预药物或措施。最新发表在Nature Neuroscience上的研究发现:小鼠神经元线粒体膜上存在大麻素CB1受体,即线粒体CB1(mt CB1)受体,在生理状态下可直接调节线粒体的呼吸和能量代谢。然而,在脑缺血再灌注损伤后,是否可以通过激活mt CB1受体改善线粒体功能从而产生神经保护作用仍不清楚,其可能的潜在机制更不明确。本研究选择原代大鼠海马神经元氧糖剥夺/复氧复糖(OGD/R)、小鼠全脑缺血再灌注(I/R)和Ca2+诱导的线粒体损伤模型,以mt CB1受体为切入点,综合应用分子生物学、免疫电镜等技术,研究激活mt CB1受体的神经保护作用,并初步探索其作用机制,从而为脑缺血再灌注损伤发生发展提供新的防治策略,为临床提供新的潜在干预靶点。实验一选择性激活mt CB1受体【目的】通过应用选择性CB1受体激动剂和透膜或非透膜拮抗剂,确定合适的选择性激活mt CB1受体方法。【方法】(1)mtCB1受体表达的时相变化。55只雄性C57BL/6小鼠被随机分为3组,分别为Sham组、BCCAO组和ACEA+BCCAO组,分别在再灌注的同时给予ACEA腹腔注射,在再灌注后2、6、24、48和72小时分别提取各组小鼠海马组织线粒体蛋白,利用Western blot检测mt CB1受体表达水平;(2)CB1受体选择性激动剂ACEA对mt CB1受体表达的影响。在体外实验,原代大鼠海马神经元被分为5组(n=5):Control组、ACEA组、AM251+ACEA组、Hemo+ACEA组和Vehicle组,分别在给药后的2小时提取线粒体蛋白及去除线粒体后剩余蛋白,利用Western blot检测CB1受体表达水平;在体内试验,40只雄性C57BL/6小鼠被随机分为5组:Control组、ACEA组、AM251+ACEA组、Hemo+ACEA组和Vehicle组,分别在给药后的2小时,利用Western blot(n=5)及免疫电镜(n=3)检测mt CB1受体表达水平;(3)OGD/R或全脑I/R损伤对mt CB1受体表达的影响。在体外实验,原代大鼠海马神经元被分为6组(n=5),分别为Control组、OGD组、ACEA+OGD组、AM251+ACEA+OGD组、Hemo+ACEA+OGD组和Vehicle+OGD组,分别在复氧复糖的同时给药,在复氧复糖后2小时提取线粒体蛋白及去除线粒体后剩余蛋白,利用Western blot检测CB1受体表达水平;在体内试验,30只雄性C57BL/6小鼠被随机分为6组(n=5),分别为Sham组、BCCAO组、ACEA+BCCAO组、AM251+ACEA+BCCAO组、Hemo+ACEA+BCCAO组和Vehicle+BCCAO组,分别在再灌注的同时给药,在再灌注后2小时提取海马组织线粒体蛋白及去除线粒体后剩余蛋白,利用Western blot检测CB1受体表达水平。【结果】(1)mt CB1受体在全脑I/R后2小时表达显著增加。与Sham组比较,全脑I/R后2小时,ACEA显著增加mt CB1受体表达(P<0.05),而在随后的时间点,其表达逐渐降低;(2)ACEA上调体外培养神经元及小鼠海马组织的mt CB1受体。与Control组比较,ACEA可以显著上调mt CB1的表达(P<0.05),能够透过细胞膜的选择性CB1受体拮抗剂AM251完全逆转了这一效应(P<0.05),而不能透过细胞膜的CB1受体拮抗剂hemopressin却未能逆转;对除去线粒体后剩余蛋白检测CB1受体表达,发现只有ACEA组的CB1受体较Control组表达增高(P<0.05);(3)mt CB1受体在OGD/R或全脑I/R损伤后表达增加。与Control组比较,OGD/R上调mt CB1受体;与Sham组比较,全脑I/R也上调mt CB1受体,ACEA可进一步增加其表达(P<0.05),这一效应可以被AM251完全逆转(P<0.05),但却不能被hemopressin所逆转;对去除线粒体后剩余蛋白进行检测,发现OGD/R或全脑I/R同样可以显著上调CB1受体(P<0.05),ACEA也可进一步增加其表达(P<0.05),而AM251和hemopressin均完全拮抗这一效应(P<0.05)。【结论】通过给予透膜的选择性CB1受体激动剂ACEA和非透膜的选择性CB1受体拮抗剂hemopressin可以选择性激活mt CB1受体。实验二激活mt CB1受体的神经保护作用研究【目的】探讨激活mt CB1受体对OGD/R和全脑I/R损伤的神经保护作用。【方法】(1)原代大鼠海马神经元被分为6组:Control组、OGD组、ACEA+OGD组、AM251+ACEA+OGD组、Hemo+ACEA+OGD组和Vehicle+OGD组,在复氧复糖的同时分别给药,在复氧复糖后24小时,分别检测各组细胞的细胞活性(n=8)、乳酸脱氢酶(LDH)释放量(n=6)和流式细胞凋亡率(n=5);(2)60只雄性C57BL/6小鼠被随机分为6组(n=10):Sham组、BCCAO组、ACEA+BCCAO组、AM251+ACEA+BCCAO组、Hemo+ACEA+BCCAO组和Vehicle+BCCAO组,在再灌注的同时分别腹腔给药,在再灌注后的24、48和72小时,分别评估各组小鼠神经行为学评分;最后一次评估后(再灌注后72小时),对各组小鼠断头取脑,TUNEL检测海马CA1区神经元凋亡率(n=5);Western blot检测海马组织凋亡蛋白表达水平(n=5)。【结果】(1)在复氧复糖后24小时,ACEA显著增加神经元活性,减少LDH释放量,降低神经元凋亡率(P<0.05),AM251能够完全逆转这一结果(P<0.05),而hemopressin仅仅部分或无逆转;(2)全脑缺血再灌注后24、48、72小时进行神经行为学评分,结果显示,ACEA显著改善3个时间点的神经行为学评分(P<0.05),AM251在3个时间点均完全逆转ACEA的神经保护作用(P<0.05),而hemopressin仅仅部分逆转这一效应;再灌注后72小时,ACEA明显减少小鼠海马CA1区TUNEL阳性细胞数目,降低海马组织活性caspase-3的表达(P<0.05),这一结果也可以完全被AM251所拮抗(P<0.05),但仅被hemopressin部分逆转。【结论】激活mtCB1受体可以减轻原代海马神经元OGD/R后的神经损伤,降低C57BL/6小鼠全脑I/R引起的神经元凋亡,改善神经功能。实验三激活mt CB1受体对神经元损伤后线粒体功能的保护作用研究【目的】证实激活mt CB1受体对全脑I/R、OGD/R或Ca2+造成线粒体损伤的保护作用。【方法】(1)激活mt CB1受体对全脑I/R损伤后线粒体超微结构的影响。18只雄性C57BL/6小鼠被随机分为6组(n=3):Sham组、BCCAO组、ACEA+BCCAO组、AM251+ACEA+BCCAO组、Hemo+ACEA+BCCAO组和Vehicle+BCCAO组,在再灌注的同时分别腹腔给药,在再灌注后72小时,对各组小鼠多聚甲醛固定,断头取脑,透射电镜观察海马CA1区神经元线粒体超微结构变化;(2)激活mt CB1受体对OGD/R损伤后细胞内ROS含量及线粒体功能的影响。原代大鼠海马神经元被分为6组(n=6):Control组、OGD组、ACEA+OGD组、AM251+ACEA+OGD组、Hemo+ACEA+OGD组和Vehicle+OGD组,在复氧复糖的同时分别给药,在复氧复糖后24小时,检测各组细胞内ROS含量;在复氧复糖后2小时和24小时,分别提取各组细胞的线粒体,检测线粒体呼吸链复合体I、II和IV活性及膜电位。(3)激活mt CB1受体对Ca2+诱导线粒体损伤后线粒体功能的影响。将从正常原代大鼠海马神经元分离纯化出的线粒体分为5组(n=6),Control组、Ca2+损伤组、0.1μM ACEA+Ca2+损伤组、1μM ACEA+Ca2+损伤组和10μM ACEA+Ca2+损伤组,在Ca2+加入前30分钟给予ACEA处理,在Ca2+加入后20分钟,分别检测各组线粒体的肿胀程度及膜电位。【结果】(1)激活mt CB1受体改善全脑I/R损伤后线粒体超微结构。Sham组的线粒体呈杆状或球状,外膜光滑平整,线粒体嵴排列整齐,结构完整;BCCAO组、AM251+ACEA+BCCAO组和Vehicle+BCCAO组的线粒体结构完全被破坏,线粒体肿胀,内部空泡化,嵴排列紊乱;ACEA+BCCAO组和Hemo+ACEA+BCCAO组的线粒体结构基本完整,但有少量空泡化,线粒体嵴有轻微断裂;(2)激活mt CB1受体降低OGD/R损伤后神经元内ROS的含量,改善线粒体呼吸链复合体活性,增加线粒体膜电位。在复氧复糖后24小时,ACEA显著降低神经元内ROS的产生(P<0.05),AM251能够完全逆转这一结果,而hemopressin仅部分逆转;在复氧复糖后2小时和24小时,ACEA可以改善OGD/R损伤后复合体I和IV的活性,增加膜电位(P<0.05),却没有增加复合体II的活性,Hemo+ACEA也可改善复合体I和IV的活性,增加膜电位(P<0.05),也同样对复合体II的活性没有影响;(3)激活mt CB1受体减轻Ca2+诱导损伤后线粒体肿胀,增加线粒体膜电位。Ca2+可以显著诱导纯化的线粒体肿胀,降低其膜电位,而通过给予ACEA直接激活mt CB1受体可以改善Ca2+诱导的线粒体损伤(P<0.05)。【结论】激活mt CB1受体可以改善全脑I/R损伤后线粒体超微结构,调节原代海马神经元OGD/R后的线粒体功能,减轻Ca2+诱导的线粒体肿胀,增加线粒体膜电位水平。实验四线粒体功能在mt CB1受体神经保护中的作用研究【目的】探讨激活mt CB1受体是否通过改善线粒体功能诱导神经保护作用。【方法】(1)线粒体呼吸链在mt CB1受体神经保护中的作用。原代大鼠海马神经元被分为5组:Control组、OGD组、ACEA+OGD组、线粒体复合体I抑制剂rotenone+ACEA+OGD组和线粒体复合体II抑制剂TTFA+ACEA+OGD组,在复氧复糖同时给药,在复氧复糖后24小时,分别检测各组细胞的细胞活性(n=8)和乳酸脱氢酶(LDH)释放量(n=6);(2)激活mt CB1受体对OGD/R损伤后线粒体通透性转换孔(m PTP)开放的影响。原代大鼠海马神经元被分为4组(n=5):Control组、OGD组、ACEA+OGD组和m PTP开放剂苍术苷(Atr)+ACEA+OGD组,在复氧复糖同时给药,在复氧复糖后2小时,分别检测各组细胞的细胞质和线粒体内细胞色素C(Cyto C)及细胞核和线粒体内凋亡诱导因子(AIF)的含量;(3)m PTP在mt CB1受体神经保护中的作用。在体外实验,原代大鼠海马神经元被分为4组:Control组、OGD组、ACEA+OGD组和Atr+ACEA+OGD组,在复氧复糖的同时给药,在复氧复糖后24小时,分别检测各组细胞的细胞活性(n=8)、LDH释放量(n=6)和流式细胞凋亡率(n=5);在体内试验,40只雄性C57BL/6小鼠被随机分为4组(n=10):Sham组、BCCAO组、ACEA+BCCAO组和Atr+ACEA+BCCAO组,在再灌注前5分钟给予脑室注射苍术苷(Atr),在再灌注的同时给予腹腔注射ACEA,在再灌注后的24、48和72小时,分别评估各组小鼠神经行为学评分;最后一次评估后(再灌注后72小时),对各组小鼠断头取脑,TUNEL检测海马CA1区神经元凋亡率(n=5);Western blot检测海马组织凋亡蛋白表达水平(n=5)。【结果】(1)线粒体复合体抑制剂对mt CB1受体神经保护作用的影响。在复氧复糖后24小时,ACEA激活mt CB1诱导的神经元活性增加,LDH释放量减少能够被线粒体复合体I抑制剂rotenone部分逆转(P<0.05),而不能被线粒体复合体II抑制剂TTFA所逆转;(2)激活mt CB1受体抑制线粒体细胞色素C释放和凋亡诱导因子(AIF)的细胞核转位。在复氧复糖后2小时,检测线粒体及去除线粒体后胞质中细胞色素C的含量,检测线粒体及细胞核中AIF的含量,结果发现,OGD/R损伤后线粒体细胞色素C释放和AIF的细胞核转位增加,ACEA可以明显阻断这一效应(P<0.05),而给予苍术苷(Atr)可以逆转ACEA的作用(P<0.05);(3)激活mt CB1受体通过抑制m PTP开放减轻OGD/R和全脑I/R损伤。在复氧复糖后24小时,ACEA显著增加神经元活性,减少LDH释放量,降低神经元凋亡率(P<0.05),而给予苍术苷(Atr)可以部分逆转ACEA的神经保护作用(P<0.05);在再灌注后24、48、72小时,ACEA显著改善3个时间点的神经行为学评分(P<0.05),在再灌注后72小时,ACEA明显减少海马CA1区TUNEL阳性细胞数目,降低海马组织活性caspase-3的表达(P<0.05),给予苍术苷(Atr)可以部分逆转ACEA的神经保护作用(P<0.05)。【结论】通过抑制线粒体复合体活性或增加m PTP的开放可以部分逆转激活mt CB1受体的神经保护作用,进一步证实mt CB1受体的神经保护作用与改善线粒体功能密切相关。【小结】上述研究结果表明,通过给予透膜的选择性CB1受体激动剂ACEA和非透膜的选择性CB1受体拮抗剂hemopressin可以选择性激活mt CB1受体,诱导神经保护作用;其机制是通过改善线粒体呼吸链复合体活性,增加线粒体膜电位,并通过抑制神经元损伤后线粒体通透性转换孔(m PTP)的开放,进一步减少线粒体内凋亡相关因子的释放和转位,抑制神经细胞凋亡。对mt CB1受体神经保护效应及机制的研究,为大麻素神经保护机制提供新的理论依据,也可能避免广泛激活CB1受体带来的成瘾、精神症状等副作用,为临床脑缺血再灌注损伤防治提供一种新的潜在的干预靶点。