论文部分内容阅读
新城疫(Newcastle diseases,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一种严重危害多种禽类健康的病毒性传染病。NDV属于副黏病毒科(Paramyxovirudae)、禽副黏病毒属(Avulavirus)。病毒基因组为单股负链RNA,长度约为15 kb。随着NDV感染和致病宿主范围不断的扩大,ND的防控面临新挑战。干扰素系统在宿主抵抗病毒中发挥着举足轻重的作用,是宿主防御病毒的重要防线。研究发现,副黏病毒编码的的V蛋白能够通过拮抗宿主干扰素系统,逃逸宿主免疫系统的清除。近年来研究发现,NDV能够通过其P基因的RNA编辑作用产生V蛋白,编码产生的V蛋白能够抵御宿主干扰素系统。NDV V蛋白发挥拮抗干扰素的功能不仅体现在能够阻断干扰素JAK/STAT信号通路,还可以直接与模式识别受体MDA5结合,抑制IFN-β的产生。现有的研究表明,V蛋白与MDA5的结合区位于其C端的半胱氨酸富集区,但是具体是哪些氨基酸残基发挥关键作用,其他残基的作用如何,目前尚不清楚。此外,有研究推测V蛋白N端的一些残基在拮抗干扰素中也发挥一定作用。为了阐明NDV V蛋白结合MDA5抑制IFN-β生成的功能域,本研究在系统分析NDV与其他副黏病毒V蛋白CTD(C-terminal domain,CTD)区序列和N端可能存在功能域的基础上,突变单个或多个氨基酸残基,从IFN-β启动子、m RNA和蛋白水平以及与MDA5相互作用方面研究突变体对拮抗IFN-β的影响,对V蛋白干扰MDA5互作拮抗IFN-β产生的功能域做了详细的研究。研究分为以下几个部分:1、CTD区锌指结构氨基酸对新城疫病毒V蛋白与MDA5相互作用的影响为了探讨NDV V蛋白C端锌指结构的组氨酸和7个半胱氨酸残基在MDA5互作中的作用。参考副流感病毒5型(Parainfluenza virus type 5,PIV5)V蛋白C端的研究结果,模拟NDV V蛋白的锌指结构,并对锌指结构的组氨酸和7个半胱氨酸残基进行突变,在启动子、m RNA和蛋白水平检测V蛋白突变体过表达对DF-1细胞IFN-β的影响。结果显示,8个V蛋白突变体均构建成功并在DF-1细胞获得高效表达,且表达量与野生型一致;NDV的野生型V蛋白具有抑制poly(I:C)诱导的DF-1细胞IFN-β启动子活性,进而影响IFN-β的转录和翻译。V蛋白C端大锌指结构区域的H177、C196、C221和C224残基是V蛋白结合MDA5抑制DF-1细胞IFN-β非必需残基,而小锌指结构区域的C200、C212、C214和C217是必需残基。2、CTD区其他保守氨基酸对新城疫病毒V蛋白与MDA5相互作用的影响为了弄清NDV V蛋白CTD区除了形成锌指结构的8个氨基酸残基外其余保守氨基酸残基在结合MDA5抑制IFN-β产生的作用,选取15个保守氨基酸进行定点突变和MDA5共同转染细胞,检测DF-1细胞IFN-β启动子水平、m RNA水平和蛋白水平的差异情况,确定影响V蛋白与MDA5相互作用的关键性残基。结果表明,V蛋白的15个突变体在DF-1细胞中的表达量与野生型一致,R178和I183对于V蛋白抑制DF-1细胞IFN-β是必需的关键残基,精氨酸和异亮氨酸突变体不能与MDA5结合而失去拮抗宿主IFN-β的能力;E180对V蛋白起支持作用,而剩余的12个氨基酸残基是V蛋白结合MDA5非必需的,它们的点突变不影响V蛋白与MDA5的相互作用。并且178位的精氨酸R变为赖氨酸K时依然能够与MDA5结合,180位的谷氨酸E变为天冬氨酸D后也保持与MDA5的结合能力,说明178位、180位和183位分别是碱性氨基酸、酸性氨基酸和异亮氨酸是V蛋白结合MDA5必需的。3、新城疫病毒V蛋白N端氨基酸对V蛋白与MDA5相互作用的影响对NDV V蛋白N端某些氨基酸残基在V蛋白与MDA5结合中的作用进行研究,选择NDV V蛋白N端的7个氨基酸残基进行定点突变,应用荧光素酶报告基因系统、real time PCR和ELSA的方法检测突变体转染细胞后的干扰素水平,免疫共沉淀验证突变体与MDA5的相互作用情况。结果表明,V蛋白N端65位(N)残基对于V蛋白与MDA5的互作有轻微影响,突变之后DF-1细胞IFN-β水平有所升高,但并不明显,启动子、转录和蛋白水平上结果一致,但在共沉淀试验中却不能体现,提示NDV V蛋白的N端氨基酸残基对V蛋白拮抗宿主细胞IFN-β产生有轻微影响。综上所述,本研究较为详细的阐明了NDV V蛋白结合MDA5抑制宿主细胞IFN-β产生的主要功能域,研究表明V蛋白不同的氨基酸残基在结合MDA5抑制宿主细胞IFN-β产生方面发挥着不同的作用。本研究可为更深一步探究NDV V蛋白拮抗干扰素机理奠定基础。