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山鸡椒(Litsea cubeba(Lour.)Pers.)是樟科木姜子属灌木或小乔木,主要分布于东南亚及我国南方各省。其果皮中含有挥发油,可作为香精香料,广泛用于食品、烟草、牙膏、肥皂、香水、化妆品、杀菌剂等多个领域。随着人们对天然绿色产品的需求不断增加,山鸡椒精油市场表现出蓬勃的生命力,国内外市场供不应求。我国是山鸡椒精油的主产国,生产的精油不仅内销强劲,出口量也年年攀升。然而,目前山鸡椒以野生资源为主,产量有限,精油含量良莠不齐,极大地限制了山鸡椒精油产业的发展,因此迫切需要选育出果实产量高、精油含量高的良种供栽培推广。我们在前期种质资源收集、保存和评价过程中,发现精油含量较高的优良雌株表现出果实产量较低(主要由冠幅较小导致)且开花较早的问题,而冠幅较大等生长性状优异的雄株开花较晚,两者花期不遇,杂交困难。为得到产量和精油含量双高的遗传改良后代,迫切需要对山鸡椒的花芽分化及花期调控进行探索,为开展山鸡椒优良种质间的杂交育种提供理论基础和技术保障。另外,花芽分化的数量和质量很大程度上影响着果实的产量和质量,从而影响精油的产量和质量,通过对山鸡椒花芽分化生理及分子机理的研究,也为今后山鸡椒的良种分子选育奠定理论基础。本研究在掌握山鸡椒花芽分化不同时期形态特征的基础上,主要分析了花芽分化过程中激素变化规律及基因表达特征;通过施加外源激素调控山鸡椒花期并探讨相关基因表达水平的变化;最后,通过拟南芥转基因和突变体相关实验分析了能够有效调控花期的靶基因的功能。主要研究结果如下:1.山鸡椒花芽分化进程与赤霉素含量密切相关。根据山鸡椒花芽分化不同时期形态特征,分析了各时期碳氮营养成分、主要矿质元素以及主要内源激素的含量变化规律。结果显示:可溶性糖,Ca、Mg、Mn、B、Zn等矿质元素以及赤霉素(GA3)含量的上升对山鸡椒整体的花芽分化有着重要的作用。山鸡椒雌、雄花芽大小均与赤霉素(GA3)的含量呈显著的正相关性。通过外源施加不同浓度的赤霉素(GA3)处理,发现均可以使山鸡椒花期提前,而200 mg·L-1的喷施浓度促花效果最好,比对照植株提前开花一周左右。结果表明,赤霉素(GA3)是影响山鸡椒花芽分化和开花的主要因素之一。2.花芽分化过程中的差异表达基因显著富集于“植物激素信号转导(plant hormone signal transduction)”途径和“淀粉和蔗糖代谢(Starch and sucrose metabolism)”途径。依据山鸡椒花芽形态特征,进行了山鸡椒雌雄花芽各5个分化时期的比较转录组,通过对分化不同时期所有的差异表达基因进行KEGG分析,发现它们显著富集于“植物激素信号转导”和“淀粉和蔗糖代谢”两个途径,表明了植物激素和糖类物质在山鸡椒花芽分化过程中的重要调控作用。3.筛选出79个与赤霉素相关的差异表达基因(DEG)。对雌雄花芽分化不同时期的差异表达基因(DEG)进行k-means聚类分析,共分成20个类群。对有明显变化趋势的15个聚类进一步进行GO富集分析,从显著富集(P<0.05)的差异表达基因中共筛选出79个与赤霉素有关的基因。4.外源赤霉素调控山鸡椒花期的响应基因筛选。通过分析山鸡椒花芽外施赤霉素前后4个时期的比较转录组数据,结果显示差异表达基因显著富集于“植物激素信号转导(plant hormone signal transduction)”通路,与花芽分化不同时期差异表达基因分析结果类似;根据外源赤霉素施加前后差异表达基因的分析,对比上述79个与赤霉素有关的基因,进一步筛选出Lc NAC1、Lc CBF3、Lc RAV2等3个对外源赤霉素表达响应强烈的转录因子。通过WGCNA构建调控网络,发现基因Lc RAV2为山鸡椒花芽分化过程的中心基因,在调控网络中与GA2OX8-1、GA2OX8-2等赤霉素相关基因存在共表达关系。利用实时定量PCR实验验证了3个赤霉素响应基因的表达模式。5.转拟南芥初步验证3个赤霉素响应基因对花期的调控作用。通过拟南芥过表达转基因实验,发现Lc NAC1基因的过表达植株较对照提前开花3 d左右,而Lc CBF3和Lc RAV2基因过表达植株分别延迟开花4 d和5 d左右。通过对拟南芥3个同源基因的突变体nac1、cbf3、rav2花期观察发现:nac1较对照延迟开花7 d左右,cbf3和rav2较对照分别提前开花5 d和3 d左右。以上结果表明,Lc NAC1基因可以促进开花,而Lc CBF3、Lc RAV2基因可以抑制开花。