背景肝脏缺血再灌注损伤是肝移植的常见问题之一,缺血后的再灌注不仅不能使肝功能恢复,反而引起移植肝功能受损,严重时导致原发性移植物无功能,直接影响肝移植的效果。随着手术技术的成熟和免疫排斥研究的深入,肝移植发展迅速,供体需求量激增,边缘供体渐为各大器官移植中心所接受。边缘供体耐受缺血缺氧能力较正常供体差,导致移植肝无功能的机会也相对增加。近年来针对缺血再灌注损伤的一些研究发现,TLR4启动了宿主天然免疫系统,从而引起心、肺、肝、肾的缺血再灌注损伤。TLR4是Toll样受体家族(TLRs)重要成员,机体可通过宿主TLRs识别病原体,从而启动先天性免疫系统。灯盏花素(Breviscapine)又名灯盏细辛,是从菊科飞蓬属植物短亭飞蓬中提取出来的黄酮类有效成分,主要成分是灯盏乙素(含量占95%以上)。研究发现灯盏花素有改善心脑血管血流量、抗血小板凝聚、抗氧自由基等作用。临床主要治疗闭塞性脑血管病及其后遗症。因其还能降低血浆纤维蛋白原含量和促进纤溶酶活性、改善微循环、清除氧自由基,因此也有保肝作用。但尚未发现其在肝移植冷保存缺血再灌注损伤中作用的研究报道。鉴于此,本课题采用SD大鼠建立原位肝移植模型,研究灯盏花素对肝脏冷保存缺血再灌注损伤是否具有保护作用；并进一步研究TLR4介导的信息通路是否参与其中。第一部分大鼠原位肝移植模型的建立目的建立大鼠原位肝移植模型,以便进行肝移植冷保存缺血再灌注损伤的研究。方法健康、成年、SPF级纯系雄性SD大鼠(Sprague-Dawley)168只,体重260-320g。实验分为两个阶段进行,其中预实验108只,系手术技巧及方法的练习；正式实验60只。手术操作步骤如下：①游离供体肝脏周围韧带、肝上、肝下下腔静脉,门静脉、肝动脉、肝外胆道及右肾静脉。②穿刺门静脉并肝素化。③使用4℃含肝素12.5U／ml的乳酸钠林格氏液行腹主动脉冷灌注,灌注满意后切取供肝。④在修肝容器中进行供肝修整和袖套安装,必须保证全程浸泡在装4℃乳酸林格氏液的修肝容器中。供肝修整完毕后,置4℃冰箱中保存待用。⑤游离受体肝脏周围韧带、肝上、肝下下腔静脉,门静脉、肝动脉、肝外胆道及右肾静脉。⑥阻断受体肝下下腔静脉、门静脉主干、肝上下腔静脉,切除受体肝脏。⑦将供肝从4℃的保存液中取出,原位置入受体腹腔,重建腔静脉、门静脉和胆管,恢复血流。检查腹腔内无出血后关腹。结果1、共进行SD-SD大鼠原位肝移植84次,其中前期预实验54次,后期定型手术30次。2、在正式实验中,供体手术时间为28.42±1.83min,供肝修整时间为36.58±3.31min,受体手术时间47.25±1.59min,无肝期为21.45±1.57min。3、受体门静脉恢复灌注后未见血栓形成,血液复流和肝脏灌注情况良好。4、54次预实验死亡23例,死亡率为42.59%(23／54)。30次定型手术3例死亡,死亡率为10%(3／30)。死亡原因包括无肝期过长、麻醉过深、空气栓塞、腹腔内出血,等。第二部分灯盏花素保护大鼠肝移植冷缺血再灌注损伤的实验研究目的探讨灯盏花素是否对大鼠肝脏冷保存缺血再灌注损伤具有保护作用。方法1.实验动物分组设计健康、成年、SPF级纯系雄性SD大鼠42只,体重260-320g,随机分为假手术组、生理盐水对照组、低剂量灯盏花素治疗组和高剂量灯盏花素治疗组。将供肝在4℃保存液保存4小时后原位植入受体。按照“二袖套”法进行大鼠原位肝移植术。于供肝恢复灌注6小时后取材。2.观察指标及方法(1)测定各组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶及天冬氨酸氨基转移酶。(2)检测各组大鼠肝组织匀浆超氧化物歧化酶、丙二醛和谷胱甘肽过氧化物酶。(3)制作石蜡切片,HE染色,于光镜下观察肝组织病理形态学表现,并进行Suzuki病理学评分。(4)制作电镜切片,在透射电镜下观察细胞的超微结构。(5)TUNEL法检测肝细胞的凋亡情况。计算凋亡指数(AI)。3..统计学分析计量资料采用均数±标准差(i±s)表示,数据用SPSS13.0软件进行统计学分析,四组均数比较采用单向方差分析(One-Way ANOVA),组间两两比较采用最小差异t检验(LSD-t)或Tamhane’s T2检验,相关性分析采用双变量相关分析。Suzuki病理评分采用Kruskal-Wallis H-test.P<0.05为差异有统计学意义。结果1、血清肝功能检测结果生理盐水对照组、灯盏花素低剂量治疗组、灯盏花素高剂量治疗组的ALT、AST水平显著高于假手术组(P<0.05)；灯盏花素治疗后ALT、AST水平较生理盐水对照组降低,其中高剂量治疗组较生理盐水对照组显著下降(P<0.05)；高剂量治疗组ALT、AST水平较低剂量治疗组降低,其中门冬氨酸氨基转移酶的降低为显著性(P<0.05)。2.肝组织匀浆SOD、MDA、GSH-Px检测结果假手术组MDA、GSH-Px的表达水平与其它三组差别显著(P<0.05)；灯盏花素治疗后MDA、GSH-Px的表达水平较生理盐水对照组差别显著(P<0.05)；高剂量治疗组MDA较低剂量治疗组有显著降低(P<0.05)。生理盐水对照组SOD表达较假手术组显著下降(P<0.05)；灯盏花素治疗组SOD较生理盐水对照组高但低于假手术组,其中高剂量治疗组相对于生理盐水对照组和低剂量治疗组均有显著升高(P<0.05)。3.肝组织病理学观察和评分假手术组：肝小叶结构大体正常,镜下肝细胞排列规则,可见双核肝细胞。生理盐水对照组：肝细胞索紊乱,并呈现多灶性的肝细胞水泡样变性、凋亡和坏死,肝窦内可见散在脱落的肝细胞核,病变分布没有特异性。低剂量组：肝细胞轻度水样变性,组织改变较生理盐水对照组轻。高剂量组：肝细胞索清晰可辨,肝细胞结构完整,排列尚规则。通过病理学评分分析,各组肝脏淤血、空泡样变、坏死差异不具有统计学意义(P>0.05),总分比较有统计学意义(P<0.05)。4.透射电镜观察假手术组：肝细胞结构正常。细胞核近圆形,核膜完整,核仁居中；细胞浆内可见线粒体、糖原颗粒、内质网、脂滴结构,其中线粒体由不同切面切成柱形、椭圆形、圆形外观,具有双层界膜,内膜内可见线粒体嵴,基质密度较高。生理盐水对照组：显示肝细胞早期凋亡的结构特点。细胞核皱缩,核内染色质固缩并凝结成块,聚集在核膜周边呈新月状或环状小体；内质网变疏松,线粒体数量明显减少,体积明显增大,线粒体内基质密度明显降低,但保持完整而清晰的双层单位膜。灯盏花素低剂量组：细胞核近圆形,核膜完整,核内染色质有向核膜边集趋势；线粒体数量减少,体积增大,基质密度降低,总体结构改变较B组轻。灯盏花素高剂量组：细胞核近圆形,核膜完整,已出现染色质颗粒状聚集；细胞质中线粒体数量没有明显变化,但分布不均,三五聚集,嵴减少,内质网扩张。结构改变程度介于C组和A组之间。5.凋亡指数(AI)大鼠肝移植后6小时各组肝细胞凋亡指数比较差异显著(P<0.001),假手术组凋亡最轻,生理盐水对照组凋亡最严重；灯盏花素治疗组凋亡较生理盐水对照组轻但比假手术组严重,且高剂量组显著低于低剂量组(P<0.05)。说明灯盏花素能减轻大鼠肝移植术后肝实质细胞的凋亡,且具有剂量依赖关系。结论1、大鼠供肝在冷保存4小时后原位植入受体,术后肝脏恢复灌注后6小时,缺血再灌注损伤明显。血清ALT、AST明显升高；肝组织SOD、GSH-Px降低、脂质过氧化物MDA升高；肝细胞出现凋亡表现。2、受体术前给予灯盏花素预处理后,可以明显减轻移植肝的缺血再灌注损伤。通过抑制氧自由基生成,降低了SOD、GSH-Px的消耗,抑制了脂质过氧化反应,脂质过氧化终产物MDA生成减少,对肝细胞损伤减轻,肝功能好转,肝细胞凋亡减少。第三部分灯盏花素对肝移植冷缺血再灌注损伤TLR4、NF-κB和细胞因子表达的影响目的研究灯盏花素是否通过抑制TLR4启动的天然免疫系统,从而减轻肝移植缺血再灌注损伤。方法1.实验动物分组设计健康、成年、SPF级纯系雄性SD大鼠42只,体重260-320g,随机分为假手术组、生理盐水对照组、低剂量灯盏花素治疗组和高剂量灯盏花素治疗组。将供肝在4℃保存液保存4小时后原位植入受体。按照“二袖套”法进行大鼠原位肝移植术。于供肝恢复灌注6小时后取材。2.观察指标及方法Western Blotting检测TLR4和NF-κB蛋白,免疫组织化学染色观测肝脏TNF-α、IL-1β在组织中的表达情况。3.统计方法计量资料用均数±标准差(x±s)表示,数据用SPSS13.0软件进行统计学分析,多组均数间比较采用方差分析,组间两两比较采用最小差异t检验(LSD-t),P<0.05为差异有统计学意义。结果1. Western Blotting检测结果假手术组肝脏TLR4蛋白的表达量极低,而经缺血再灌注损伤6小时后,生理盐水对照组肝脏TLR4蛋白表达量显著升高(P<0.05)。经灯盏花素处理后TLR4蛋白表达受到抑制(P<0.05),且高剂量组对TLR4的抑制程度较C组显著(P<0.05)。2.免疫组化观测结果假手术组肝细胞内未见TNF-α、IL-1β着色的阳性表达(-)；经冷缺血再灌注损伤6小时后,生理盐水对照组大鼠的肝细胞的细胞浆、细胞核内均出现深棕黄色染色(++～+++),尤以细胞浆内表达明显；经灯盏花素处理后,低剂量组TNF-α的阳性表达强度下降(+～++),阳性表达主要在细胞浆；而高剂量组只表现为细胞浆内轻微黄染(+)。结论1、TLR4介导的天然免疫反应参与了大鼠原位肝移植冷保存再灌注损伤的过程,其信息通路为“LPS→TLR4→核因子κB→细胞因子”。2、采用灯盏花素预处理能够保护大鼠肝移植的冷缺血再灌注损伤,通过抑制TLR4和核因子κB,减少下游TNF-α、IL-1β等炎症性细胞因子的分泌,从而减轻移植肝的缺血再灌注损伤。