目的：血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell, VSMC）异常增殖是血管增殖性疾病，如动脉粥样硬化、血管再狭窄、高血压等发生发展的基本细胞病理学基础。锌指转录因子Krüppel-like factor4（KLF4）是一种多能转录因子。KLF4不仅调节细胞增殖、分化和炎症基因表达，而且也是将体细胞重编程为类多能干细胞（iPS）必不可少的4种转录因子之一。近年大量研究表明，在VSMC中，KLF4不仅调节VSMC标志基因及细胞周期调节基因的表达，而且还与多种MicroRNA（miRNA）相互调节，在VSMC表型转化过程中发挥重要的作用。KLF4可被多种细胞因子激活，如转化生长因子β1（transforming growth factor β1, TGF-β1），全反式维甲酸（all-trans retinoic acid, ATRA）和血小板源性生长因子BB（platelet-derived growth factor BB，PDGF-BB）。我室最近的研究表明，TGF-β1通过Smad和p38信号途径诱导KLF4磷酸化，磷酸化型KLF4与Smad2/3相互作用协同激活TGF-β I型受体（TGF-β type I receptor,TβRI）的表达，进而抑制VSMC的周期进程并促进分化。此外，我们还发现，ATRA通过激活JNK和p38信号通路诱导KLF4磷酸化以及KLF4与组蛋白乙酰转移酶p300的相互作用，进而激活VSMC标志基因平滑肌22alpha（smooth muscle22alpha，SM22α）表达；PDGF-BB通过激活ERK和PI3K/Akt信号通路诱导KLF4脱磷酸化以及KLF4与组蛋白去乙酰基转移酶HDAC2的相互作用，进而阻抑SM22α表达。因此，影响VSMC表型的环境因子刺激VSMC增殖和诱导VSMC分化都需要KLF4参与，KLF4发挥哪种作用取决于与它相互作用的辅助因子以及它的修饰状态。进一步研究促增殖和促分化信号对KLF4修饰状态及其与其他转录因子相互作用的影响，深入探究KLF4在VSMC表型转化中的作用及机制，对防治血管重塑性疾病具有重要意义。血管紧张素II（angiotensin II, Ang II）是肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system, RAS）中主要的生物活性肽。Ang II能促进VSMC增殖，在心血管疾病的发生发展中发挥重要的作用。Ang II绝大多数已知的生理及病理生理学效应是通过其作用于Ang II1型受体（Ang IItype1receptor, AT1R）来实现的。因此，AT1R表达量的多少在一定程度上决定了Ang II的生物学效应，研究AT1R基因的转录调控具有十分重要的意义。多种细胞因子可影响AT1R的表达，如胰岛素样生长因子（insulin-likegrowth factor）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF-α）和维甲酸（retinoic acid）等。Meijering等的研究表明，在VSMC中，TGF-β1抑制AT1R基因的转录，但对于其确切的转录调控机制尚不清楚。通过对AT1R基因启动子区-1423/+33这段序列的分析，我们发现，该区域包含4个KLF4结合元件，推测KLF4可能是参与AT1R基因转录调控的重要转录因子。为此，我们对TGF-β1-KLF4通路在AT1R基因转录调控及VSMC增殖中的作用进行了深入的研究。方法：细胞培养，腺病毒表达载体及质粒载体的构建，定点突变分析，小干扰RNA转染，RNA提取及实时定量PCR分析，Western印迹分析，荧光素酶报告基因分析，染色质免疫共沉淀分析，寡核苷酸pull-down分析，免疫共沉淀分析，BrdU掺入分析等。结果：1. KLF4介导TGF-β1对AT1R表达的抑制作用本部分实验首先在不同种属、不同来源的平滑肌细胞（smooth musclecell, SMC）中检测TGF-β1对KLF4和AT1R表达的影响。再用靶向KLF4的siRNA（siKLF4）和KLF4腺病毒表达载体（pAd-KLF4）分别转染VSMC，在VSMC中敲低KLF4表达或使其过表达的基础上，检测TGF-β1对AT1R表达的影响。构建AT1R基因启动子指导的荧光素酶报告基因载体，与KLF4表达质粒或siKLF4共转染细胞后，观察KLF4敲低和过表达对报告基因表达的影响。实验结果如下：1.1在不同种属的VSMC中，TGF-β1对KLF4和AT1R表达产生不同的影响Western blot分析结果显示，在大鼠主动脉VSMC和大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMC）中，TGF-β1以浓度（0.5、1、2、4ng/mL）和时间（3、6、12、24h）依赖的方式促进KLF4、抑制AT1R蛋白表达；在人主动脉平滑肌细胞（HASMC）中，TGF-β1以浓度（0.5、1、2、4ng/mL）和时间（6、12、24h）依赖的方式抑制KLF4和AT1R蛋白表达。实时定量PCR结果与上述结果一致，在大鼠VSMC和PASMC中，TGF-β1以浓度（0.5、1、2、4ng/mL）和时间（2、4、8、16h）依赖的方式促进KLF4、抑制AT1R mRNA表达；在HASMC中，TGF-β1以浓度（0.5、1、2、4ng/mL）和时间（2、4、8、16h）依赖的方式抑制KLF4和AT1R mRNA表达。1.2KLF4介导TGF-β1对AT1R蛋白表达的抑制作用用siKLF4和pAd-KLF4分别转染VSMC，在VSMC中敲低KLF4表达或使其过表达的基础上，检测TGF-β1对AT1R表达的影响。Western blot分析结果显示，敲低内源性KLF4表达后，AT1R蛋白表达水平降低，TGF-β1对AT1R的表达没有明显影响；过表达KLF4后，AT1R蛋白表达水平明显升高，TGF-β1对AT1R表达产生明显的抑制作用。1.3KLF4介导TGF-β对AT1R启动子活性的阻抑用siKLF4或GFP-KLF4质粒转染293A细胞，在敲低内源性KLF4表达或使其过表达的基础上，检测TGF-β信号对AT1R基因启动子指导的荧光素酶报告基因活性的影响。结果显示，敲低内源性KLF4的表达后，AT1R基因启动子活性降低，激活TGF-β信号对该基因的启动子活性没有明显影响；过表达KLF4后，AT1R基因启动子活性明显升高，激活TGF-β信号对该基因启动子活性产生明显的抑制作用。2. TGF-β1通过调节KLF4-Sp1和KLF4-PPAR-γ复合物在AT1R基因启动子上的结合活性抑制AT1R基因表达磷酸化修饰是调节蛋白质与蛋白质相互作用的主要方式。TGF-β1可通过激活Smad和非Smad信号途径使KLF4发生磷酸化修饰而导致其与辅助因子的结合或解离。上述实验已经阐明，KLF4在TGF-β1抑制AT1R基因表达中发挥重要的作用，本部分实验进一步探讨在TGF-β1作用下，KLF4如何调控AT1R基因表达。重点研究TGF-β1对KLF4不同位点磷酸化修饰的影响及其介导途径，探讨KLF4磷酸化修饰对其与其他转录因子相互作用的影响。2.1TGF-β1促进KLF4与PPAR-γ相互作用，抑制KLF4与Sp1相互作用免疫共沉淀分析结果显示，在基础状态下，KLF4分别与PPAR-γ、Sp1和NF-κB形成复合物。VSMC在TGF-β1（2ng/mL）刺激5、10、20、40min后，随着刺激时间的延长，KLF4与PPAR-γ的结合明显增加，与Sp1的结合逐渐减少，交互免疫沉淀也得到相似的结果。TGF-β1对KLF4与NF-κB间的相互作用没有明显影响。2.2TGF-β1通过激活PKC-δ信号通路诱导KLF4苏氨酸残基磷酸化促进Sp1与KLF4解离VSMC经TGF-β1（2ng/mL）刺激5、10、20、40min后，分别用抗磷酸化丝、苏、酪氨酸抗体对细胞裂解液进行免疫沉淀后检测磷酸化KLF4的水平。结果显示，随着TGF-β1刺激时间的延长，KLF4的丝、苏氨酸磷酸化水平逐渐升高；同时，TGF-β1刺激后，磷酸化型PKC-δ（p-PKC-δ）水平以及KLF4与PKC-δ的相互作用显著升高。以PKC-δ抑制剂Rottlerin处理VSMC，阻断PKC-δ信号通路的活化后，再以2ng/mL的TGF-β1刺激细胞40min。Western blot结果显示，Rottlerin预处理细胞可显著抑制KLF4的苏氨酸磷酸化及其与PKC-δ的相互作用；同时，Rottlerin可阻断TGF-β1诱导的Sp1与KLF4解离，但不影响KLF4与PPAR-γ相互作用。用靶向PKC-δ的siRNA（siPKC-δ）敲低内源性PKC-δ表达后，TGF-β1对KLF4苏氨酸磷酸化水平及其与Sp1的结合不再产生明显影响。此外，用Rottlerin或siPKC-δ处理VSMC后，TGF-β1对AT1R表达也不再产生明显影响。以上实验证明，PKC-δ被TGF-β1激活后，入核与KLF4结合，使其苏氨酸残基发生磷酸化，磷酸化型KLF4与Sp1解离，进而影响AT1R的表达。KLF4苏氨酸磷酸化位点定点突变实验证明，转染KLF4苏氨酸磷酸化位点突变体（T401A、T410/412A）的细胞再用TGF-β1处理时，KLF4苏氨酸磷酸化水平明显降低；此外，第401位苏氨酸突变后，TGF-β1对KLF4与Sp1的结合不再产生明显影响。这些结果提示，TGF-β1通过激活PKC-δ信号通路使KLF4的多位苏氨酸（T401、T410/412）发生磷酸化，但第401位苏氨酸的磷酸化是介导KLF4与Sp1解离的关键位点。2.3TGF-β1通过激活Smad信号通路诱导KLF4丝氨酸残基磷酸化，促进KLF4与PPAR-γ相互作用上述实验结果提示，TGF-β1诱导的KLF4与PPAR-γ相互作用不是通过PKC-δ信号通路介导的，即与KLF4苏氨酸位点的磷酸化无关。我室以前的研究结果表明，TGF-β1可通过激活Smad信号通路诱导KLF4丝氨酸残基磷酸化，因此，我们推测，TGF-β1可能通过激活Smad信号通路诱导KLF4丝氨酸残基磷酸化进而促进KLF4与PPAR-γ相互作用。为此，用SB431542处理VSMC，特异性阻断Smad信号通路的活化后，再以2ng/mL TGF-β1刺激细胞40min。免疫共沉淀分析结果显示，在SB431542预孵育的VSMC中，TGF-β1对KLF4丝氨酸磷酸化及其与PPAR-γ的结合不再产生明显影响，却仍然能促进Sp1与KLF4解离。用靶向Smad2或Smad3的siRNA（siSmad2或siSmad3）敲低内源性Smad2、Smad3表达后，TGF-β1对KLF4与PPAR-γ相互作用不再产生明显影响。此外，用SB431542、siSmad2或siSmad3处理VSMC后，TGF-β1对AT1R的表达也不再产生明显影响。上述结果表明，TGF-β1通过激活Smad信号通路诱导KLF4丝氨酸残基发生磷酸化修饰，丝氨酸位点发生磷酸化的KLF4能募集PPAR-γ与之相结合，进而影响AT1R基因的表达。KLF4丝氨酸磷酸化位点定点突变实验也证明了上述结论，转染KLF4丝氨酸磷酸化位点突变体（S470A）的细胞再用TGF-β1处理时，KLF4丝氨酸磷酸化水平及其与PPAR-γ相互作用均明显降低。2.4Sp1促进KLF4对AT1R基因的转录激活，PPAR-γ抑制KLF4对AT1R基因的转录激活为了检查KLF4与Sp1或PPAR-γ相互作用在调节AT1R基因表达中的意义，我们进行了报告基因分析。结果发现，KLF4和Sp1均能促进AT1R基因启动子的转录活性；KLF4和Sp1表达载体共转染使AT1R基因启动子活性比转染其中一种表达质粒明显升高，但同时激活TGF-β信号后，该基因启动子活性明显降低；单独转染PPAR-γ表达质粒对AT1R基因启动子活性没有明显影响；KLF4和PPAR-γ表达载体共转染细胞时，PPAR-γ过表达能明显抑制KLF4对AT1R基因启动子的激活作用，同时激活TGF-β信号后，AT1R基因启动子活性下降的更加明显。AT1R基因启动子区-1423/+33序列中包含4个KLF4结合位点（TCE1、TCE2、TCE3、TCE4）和1个Sp1结合元件（GC-box）。为了观察KLF4是通过哪个/些位点对AT1R基因进行转录调控，我们分别对上述5个位点进行缺失突变，并进行报告基因分析。结果发现，缺失TCE4元件后，KLF4对AT1R基因的转录激活作用及Sp1和KLF4的协同激活作用消失，PPAR-γ质粒无论单独转染还是与KLF4质粒共转染，对AT1R基因启动子活性均没有明显影响。2.5TGF-β1使KLF4、Sp1和PPAR-γ在AT1R基因启动子上的装配发生改变上述结果表明，TCE4元件是KLF4、Sp1和PPAR-γ对AT1R基因进行转录调控的关键位点，提示，TGF-β1可能通过影响这几种转录因子在TCE4元件上的装配来调控AT1R基因的表达。为了证明这点，我们进行了染色质免疫沉淀（ChIP）分析。结果发现，VSMC在TGF-β1刺激5、10、20、40min后，随着刺激时间的延长，KLF4和PPAR-γ与TCE4元件的结合明显增加，在刺激20、40min后增加最明显；Sp1与TCE4元件的结合逐渐减少，在刺激10min后明显减少，刺激20min后，几乎检测不到结合，用Rottlerin阻断PKC-δ信号的活化后，TGF-β1对Sp1与TCE4元件的结合不再产生影响。Oligo pull-down分析结果进一步证实，TGF-β1抑制Sp1与TCE4元件的结合，促进KLF4和PPAR-γ与该元件的结合。连续ChIP分析结果进一步显示，在基础状态下，在用Sp1抗体再次沉淀KLF4抗体沉淀得到的染色质片段或用KLF4抗体再次沉淀Sp1抗体沉淀得到的染色质片段时，二次沉淀物中仍能扩增得到含TCE4元件的DNA片段，TGF-β1刺激VSMC40min后，二次沉淀物中不能扩增出上述DNA片段。按相同的方法，用KLF4和PPAR-γ抗体进行交互连续ChIP分析，结果发现，在基础状态下，二次沉淀物中不能扩增出含TCE4元件的DNA片段，但在TGF-β1刺激的VSMC中，二次沉淀物中可检测到上述DNA片段。以上结果表明，在基础状态下，KLF4与Sp1在TCE4元件上形成复合物，协同促进AT1R基因表达；TGF-β1刺激后，Sp1与KLF4解离，同时KLF4与PPAR-γ形成复合物，结合于该元件上，抑制AT1R基因的转录。3. TGF-β1通过下调AT1R表达抑制Ang II诱导的VSMC增殖上述实验主要对TGF-β1抑制AT1R基因转录的机制进行了深入研究。本部分实验进一步探讨TGF-β1抑制AT1R表达对VSMC增殖的影响。3.1TGF-β1促进VSMC标志基因表达Western blot结果表明，TGF-β1显著抑制AT1R蛋白表达，并具有明显的时效（6、12、24、48h）和量效（0.5、1、2、4ng/mL）关系。以TGF-β1浓度为2ng/mL作用于VSMC48h的抑制作用最强。SM22α和SMα-actin表达是VSMC处于分化状态的重要分子标志，PCNA表达是VSMC处于增殖状态的重要分子标志。采用Western blot分析，检测TGF-β1对VSMC标志基因表达的影响。结果显示，TGF-β1以浓度（0.5、1、2、4ng/mL）和时间（6、12、24、48h）依赖的方式促进分化标志基因SM22α和SMα-actin表达，抑制增殖标志物PCNA表达。3.2TGF-β1抑制VSMC增殖BrdU掺入分析实验结果显示，TGF-β1以浓度（0.5、1、2、4ng/mL）和时间（6、12、24、48h）依赖的方式抑制VSMC增殖，以TGF-β1浓度为2ng/mL作用于VSMC48h的抑制作用最强。3.3TGF-β1通过下调AT1R表达抑制Ang II诱导的VSMC增殖在VSMC中，Ang II通过与AT1R相互作用激活细胞增殖信号，促进细胞增殖。因此，AT1R表达异常可影响Ang II的促增殖活性。TGF-β1既然能抑制AT1R表达，是否能抑制Ang II的促增殖活性呢？为此，我们用2ng/mL的TGF-β1预孵育VSMC6h后，再以Ang II（10-7M）刺激细胞24h。Western blot结果显示，Ang II抑制SM22α和SMα-actin表达，促进PCNA表达；TGF-β1能消除Ang II对SM22α和SMα-actin表达的抑制作用，同时阻断Ang II对PCNA表达的促进作用。BrdU掺入分析实验结果显示，在以TGF-β1预孵育的VSMC中，Ang II的促增殖作用明显降低。前面的实验证实，在TGF-β1作用前后，KLF4与Sp1和PPAR-γ以不同的组合方式调节AT1R基因表达。我们进一步检测这几种转录因子在TGF-β1抑制VSMC增殖中的作用。用靶向KLF4、Sp1和PPAR-γ的siRNA（siKLF4、siSp1和siPPAR-γ）单独或联合转染VSMC，在VSMC中敲低这几种转录因子表达的基础上，用BrdU掺入分析实验检测TGF-β1对细胞增殖的影响。结果发现，敲低内源性KLF4或/和PPAR-γ表达，能阻断TGF-β1的抗增殖作用；相反，敲低内源性Sp1表达后，TGF-β1的抗增殖作用更加明显。这些结果表明，Sp1与KLF4的解离以及KLF4与PPAR-γ的结合在TGF-β1抑制VSMC增殖中发挥重要的作用。结论：KLF4介导TGF-β1对AT1R基因表达的抑制作用；TGF-β1通过激活PKC-δ信号通路诱导KLF4苏氨酸残基磷酸化而促进Sp1与KLF4解离；TGF-β1通过激活Smad信号通路诱导KLF4丝氨酸残基磷酸化而促进KLF4与PPAR-γ相互作用；在基础状态下，Sp1与KLF4形成复合物，结合于AT1R基因启动子的TCE4元件上，协同促进AT1R基因表达；当TGF-β1信号激活后，在Sp1与KLF4解离的同时，KLF4与PPAR-γ形成复合物，结合于TCE4元件上，抑制AT1R基因表达；TGF-β1通过下调AT1R基因表达而抑制Ang II诱导的VSMC增殖。