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第Ⅰ部分体外实验:超声辐照微泡介导rAAV2-EGFP转染RPE细胞的实验研究
目的:探讨超声辐照微泡造影剂能否安全有效地增强rAAV2-EGFP对体外培养的RPE细胞的转染效率。
资料与方法:(1)超声辐照SonoVue、全氟丙烷人血白蛋白微球介导rAAV2-EGFP转染人RPE细胞的实验研究。对照组为rAAV2-EGFP,实验组分为单独超声辐照组,单独超声微泡组,超声辐照微泡组,比较不同条件对基因转染效率的影响；台盼兰染色测定细胞生存率或MTS测定细胞增殖；不同条件UTMD预辐照rAAV2后转染hRPE细胞,与未预辐照组转染效率比较。(2)超声辐照SonoVue介导rAAV2-EGFP转染大鼠RPE细胞的实验研究。分组方法同前,比较不同条件对基因转染效率的影响,并与丁酸钠的促转染效率进行对比研究；MTS测定细胞增殖。
结果：(1)单独超声辐照、单独SonoVue及白蛋白微球组rAAV2-EGFP转染人RPE细胞的效率与对照组比较无显著性差异；优化条件下超声靶向破坏SonoVue或白蛋白微球组的转染效率分别为31.27±1.97％和29.13±7.34％,均显著高于对照组；两组间的转染效率比较无显著性差异；两组细胞生存率分别为97.38±3.16％和94.4±0.05％；以优化条件预辐照rAAV2与未预辐照组比较rAAV2-EGFP转染人RPE细胞的效率无显著性差异。(2)单独超声辐照,单独SonoVue能够显著提高rAAV2-EGFP转染大鼠RPE细胞的效率。丁酸钠组的转染效率显著高于超声辐照及超声微泡组,但细胞生存率显著降低。
结论：(1)超声辐照SonoVue或全氟丙烷人血白蛋白微球能够显著提高rAAV2-EGFP转染人RPE细胞的效率,并且不影响细胞生存率及rAAV2活性。(2)单独超声辐照,单独SonoVue能够显著提高rAAV2-EGFP转染大鼠RPE细胞的效率。丁酸钠组的转染效率虽然显著提高,但细胞毒性大。
第Ⅱ部分体内实验:超声辐照SonoVue介导rAAV2-EGFP在体转染大鼠视网膜的实验研究
目的:探讨超声辐照SonoVue介导rAAV2-EGFP在体转染大鼠视网膜的效率和安全性。
资料与方法:采用玻璃体腔及视网膜下间隙注射rAAV2与生理盐水或微泡的混合液。玻璃体腔注射(10只)分为2组:rAAV+NS和rAAV+MBs+US(UTMD)组；视网膜下间隙注射(78只)分为4组:rAAV+NS；rAAV+MBs；rAAV+NS+US；rAAV+MBs+US(UTMD)。超声辐照条件为:1 MHz,PRF100 Hz,2 W/cm2,50％的脉冲波辐照5 min。术后第4、7、35、49及120 d荧光体视镜动态观察视网膜绿色荧光并利用Axiovision3.1软件进行定量分析。眼底铺片观察阳性细胞分布范围、强度及细胞形态。冰冻切片观察荧光的分布,病理切片观察视网膜组织有无损伤。
结果：玻璃体腔注射组荧光体视镜持续观察两个月未见荧光。视网膜下间隙注射组:第4天,LITMD组眼底出现绿色荧光的大鼠只数显著多于其他三组；第4、7和35 d,UTMD组的积分光密度值显著高于其他三组,第49 d,120 d时各组间无显著性差异；眼底铺片显示UTMD组的阳性细胞数量及荧光强度高于其他三组；眼底铺片及冰冻切片显示rAAV转染到了视网膜色素上皮细胞层及神经上皮细胞层,UTMD组的组织切片显示细胞排列整齐,层次清晰,无明显炎症细胞浸润。
结论：超声辐照SonoVue在体内能加速并安全有效地提高rAAV2-EGFP转染大鼠视网膜的效率。