【摘 要】
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脱落酸（Abscisic Acid,ABA）作为一种植物体内重要的激素;与动物的一些疾病,炎症反应等疾病也有联系。明晰脱落酸ABA在小鼠脑中的结合受体:羊毛硫氨酸合成酶C样蛋白LANCL2,过氧化物酶体增殖物激活受体PPARγ及其脑区分布;探究ABA对帕金森病自噬和凋亡标志物的影响。研究目的本研究将会通过构建帕金森小鼠动物模型,明晰脱落酸ABA在小鼠脑中的结合受体:羊毛硫氨酸合成酶C样蛋白LANC
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脱落酸（Abscisic Acid,ABA）作为一种植物体内重要的激素;与动物的一些疾病,炎症反应等疾病也有联系。明晰脱落酸ABA在小鼠脑中的结合受体:羊毛硫氨酸合成酶C样蛋白LANCL2,过氧化物酶体增殖物激活受体PPARγ及其脑区分布;探究ABA对帕金森病自噬和凋亡标志物的影响。研究目的本研究将会通过构建帕金森小鼠动物模型,明晰脱落酸ABA在小鼠脑中的结合受体:羊毛硫氨酸合成酶C样蛋白LANCL2,过氧化物酶体增殖物激活受体PPARγ及其脑区分布。并用ABA对构建的αA53T过表达型mn9d帕金森氏病细胞模型进行干预,探究不同μM ABA对帕金森病细胞模型中细胞中自噬性凋亡及相关自噬标志物的变化。研究方法（1）12只C57BL/6J雄鼠,随机分为2组:生理盐水组（Saline）、帕金森氏病模型（MPTP）。在模型建立7天后对小鼠进行行为学测试分析,灌注取脑分离脑区后进行低温保存。通过免疫组化染色的组织形态观察小鼠不同脑区中LANCL2和PPARγ的分布情况。（2）将两种重组质粒扩增并验证发现DNA琼脂糖凝胶电泳和公司测序结果表明两种重组质粒扩增无误。对野生型mn9d细胞采用瞬时转染构建过表达αWT、αA53T帕金森细胞模型,并进行多次细胞转染预实验。（3）观察并检测野生细胞内LANCL2和PPARγ的含量。Western Blot检测αsyn、LC3、Caspase-3、LANCL2和PPARγ的表达。（4）用不同含量的脱落酸对mn9d细胞进行干预。脱落酸干预后的过表达αWT、αA53T mn9d的细胞中的自噬及凋亡标志物蛋白质用Western Blot和Immuno Fluorescence实验检测其表达量。研究结果（1）在野生型小鼠中的纹状体区海马区和黑质区LANCL2表达量较多,PPARγ在OB中的表达量较多。MPTP药物处理组则相对少。（2）DNA琼脂糖凝胶电泳发现400 bp marker附近出现目的基因αWT、αA53T亮带,之后把基因转染到mn9d细胞内。αsyn蛋白含量在转染目的基因的mn9d细胞中比较:αsyn A53T＞αsyn WT＞vector。免疫荧光实验显示αsyn蛋白聚集,LC3也出现较亮的斑点。观察比较凋亡标志物Caspase-3荧光密度发现细胞病理性凋亡有增加。综上所述说明PD细胞模型构建成功。（3）αsyn和LANCL2,PPARγ蛋白质在转染了αsyn WT、αsyn A53T的mn9d细胞中都呈正相关关系且皮尔森相关系数αsyn WT大于αsyn A53T。(4不同μM ABA处理mn9d细胞后自噬蛋白LC3的平均灰度值比较结果发现αA53T（0）＞αWT＞50＞100＞200。200μM ABA组与PD组相比P＜0.05,具有显著性差异。IF观测结果:αA53T（0）＞50＞200＞100,平均荧光密度:与PD模型组相比,实验组200μM ABA有极显著性差异,p＜0.01。LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降,说明细胞自噬减少。综上ABA减少细胞自噬发生,且PD模型组与实验组200μM ABA相比,P＜0.05有显著性差异。（5）在加入外源ABA之后BAX蛋白含量有下降趋势,然而Bcl-2蛋白含量均有增加。Bcl-2/BAX数值上升,说明细胞凋亡减少。不同含量（μM）ABA对减少凋亡的影响为:200＞100＞50＞0。与PD组相比,50μM、100μM组差异性显著,P＜0.05,200μM组差异极显著,P＜0.01。研究结论（1）细胞核共定位分析可知PPARγ绝大部分定位在OB脑区细胞核上;LANCL2主要定位在小鼠SN脑区细胞核上。（2）ABA受体LANCL2和PPARγ在野生mn9d细胞中的表达无显著差异。（3）αsyn和LANCL2,PPARγ在转染了αsyn WT和αsyn A53T的mn9d细胞中都具有正相关关系。（4）自噬标记物Beclin1表达下降,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的数值下降,Bcl-2/BAX增加,可知转染了αA53T基因的细胞经过ABA干预后细胞自噬减少。（5）在当前的试验中发现ABA能够减少帕金森病中脑多巴胺能细胞的病理性自噬和凋亡的作用。
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