论文部分内容阅读
莲藕(Nelumbo nucifera Gaertn.)是睡莲科莲属多年生水生草本植物,原产于中国和印度,现于东南亚、日本及中国均有栽培。莲藕是我国种植面积最大的水生蔬菜,其产品包括鲜藕、莲籽和藕粉,含有丰富的蛋白质、淀粉、矿质营养及多种维生素,具有较好的保健功能,深受大众消费者的喜爱。目前莲藕栽培种对盐敏感,而耐盐品种存在于野生资源中。随着我国土壤盐渍化范围及沿海滩涂面积不断扩大,培育莲藕耐盐新品种,使其在含盐量较高的盐渍化土壤中栽培,既有利于提高土地利用率,同时又改善了当地环境。质膜内在蛋白(PlasmaMembrane InstrinsicProtein,PIP)是目前研究较多的水通道蛋白中的一种,研究表明PIP具有提高植物耐盐性的作用[1]。由于受细胞膜的限制,PIP可能通过介导叶和根中水分的跨细胞运输来提高植物的耐盐能力。因此,本研究从耐盐野生莲中克隆了PIP家族基因,并研究了其在逆境胁迫下的表达特征,同时对盐诱导的基因(NnPIP1-2、NnPIP2-1和NnPIP2-7)进行了过表达载体的构建,结果如下:1、采用RT-PCR技术,从野生耐盐莲藕资源H5中克隆得到8个PIP家族基因,基因核苷酸全长在843 bp-864 bp之间。通过对比NCBI数据库,我们发现本实验得到的莲藕PIP家族基因和拟南芥、水稻和玉米PIP家族基因的同源性较高,家族基因之间的同源性在67%-90%,因此把本实验克隆的基因命名为NnPIPs。进一步研究表明NnPIP1与AtPIP1和NnPIP2与AtPIP2之间的同源性要高于NnPIP1与NnPIP2之间的同源性,表明NnPIP1和NnPIP2属于同一基因家族中的2个亚类。在基因结构上,NnPIPs中每个成员都具有6个α-跨膜螺旋和5个相连接的环(A环-E环),且B环和E环上均有一个NPA(Asn-Pro-Ala)结构域,这是植物体运输水和CO2等一些小分子的基本结构。2、利用半定量RT-PCR及qRT-PCR技术,以β-actin为内参,分别在NaCl、甘露醇、ABA、低温和PEG处理0 h、6 h、12 h、18 h、24 h研究了NnPIPs在莲藕H5中的表达特性。结果表明:在250 mMNaCl处理下,NnPIP1-2的表达量在0-24 h呈上调趋势,处理24 h达到最高,NnPIP2-和NnPIP2-7的表达量在0-12 h呈上调趋势,12 h后达到最高,NnPIP1-3和NnPIP1-4的表达量在NaCl处理后下降,NnPIP1-1和NnPIP2-8在处理的时间内不受盐诱导,表达量无显著改变;在200mM甘露醇处理下,NnPIP1-1、NnPIP1-2、NnPIP1-3、NnPIP1-4、NnPIP2-1和NnPIP2-7的表达量均无显著改变,NnPIP2-8的表达量在处理12h后显著增加,18h表达量达到最大值;在50μMABA处理下,NnPIP1-3、NnPIP2-1、NnPIP2-7和NnIP2-8的表达量在ABA处理后6 h至18 h期间呈不同程度的增加,NnPIP1-1、NnPIP1-2和NnPIP1-4的表达量在处理时间内无显著变化;在低温(4℃)处理下,NnPIP1-1和NnPIP2-7的表达量在低温处理后18 h达到最大,NnPIP1-2、NnPIP1-3和NnPIP2-8的表达量在处理24 h内无显著变化,NnPIP1-4和NnPIP2-1的表达量在0-24 h内呈下降趋势;利用10%PEG6000处理莲藕幼苗24h,发现NnPIP1-1、NnPIP1-2、NnPIP1-3、NnPIP2-1、NnPIP2-7和NnPIP2-8 的表达量在 24 h 内显著增加,而NnPIP1-4的表达量先下降,然后上升。以上数据表明,NnPIPs在响应不同逆境胁迫时,其表达模式具有多样性特征。3、本实验利用pAMBIA 1301过表达载体对上述3个盐诱导的PIP家族基因(NnPIP1-2、NnPIP2-1、NnPIP2-7)进行了载体构建,以便进一步研究基因功能。通过双酶切和PCR鉴定,我们认为成功地构建了pAMBIA1301-NnPIP1-2、pAMBIA1301-NnPIP2-1和pAMBIA1301-NnPIP2-7 过表达载体。