脑血管疾病是严重危害人类健康的疾病之一，致残率和致死率均较高。缺血性脑血管疾病治疗的关键在于挽救缺血半暗带濒临死亡的神经元和促进损伤后神经功能的恢复。神经组织，尤其是胚胎神经干细胞移植被认为是可能有潜在应用价值的手段。但是，由于存在的伦理问题、免疫排斥问题，从而限制了其广泛应用。大量研究发现有限数量的骨髓间质千细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)治疗脑缺血模型后，损伤的神经功能确定有明显的改善。探讨MSCs是通过什么机制促进缺血脑损伤神经功能的修复是目前脑缺血研究的重点。 体外研究证明，MSCs可以不断分泌血管内皮生长因子(vascular endothelialgrower factor,VEGF)等细胞营养因子，这些营养因子是细胞存活、生长、分化的重要物质。研究还发现，应用外源性VEGF能够促进缺血脑内血管增生，防止神经细胞凋亡；在血管系统能上调损伤区SDF-1表达募集CXCR<,4>阳性的细胞。因此，有必要弄清移植到脑内的MSCs是否通过产生VEGF等细胞营养因子，从而发挥对缺血损伤神经元的保护及修复作用。本课题从骨髓间质干细胞与缺血损伤的神经元凋亡和pax6阳性细胞存活存在的时间和空间的相互关系入手，着重从细胞和分子水平研究MSCs对缺血损伤神经元的保护及修复作用及其机理；并通过MSCs移植，进一步探讨MSCs移植治疗局灶性脑缺血的效果，移植到脑内的MSCs产生VEGF的情况，以及神经细胞凋亡、pax6阳性细胞存活、分化和迁移的变化，为临床治疗脑缺血、促进神经功能恢复提供新的方法和思路。 一、缺氧损伤条件下存活的MSCs对细胞因子表达的影响 采用P5-10代的骨髓间质干细胞进行有关实验。用流式细胞仪检测鼠MSCs的表面抗原：采用逆转录．多聚酶链式反应检测在正常条件、缺氧条件(2﹪O<,2>，93﹪N<,2>，5﹪CO<,2>)下培养的MSCs和细胞移植后1天，海马和皮质VEGF mRNA的表达情况。实验数据提示：MSCs表面抗原CD44、CD29阳性和CD45、CD34阴性：MSCs诱导分化后神经元特异性烯醇酶(neurone specific enolase，NSE)免疫反应阳性；缺氧条件下培养MSCs能促进自身NGF、BDNF和VEGF mRNA表达；移植入缺血脑内的MSCs能促进皮质组织VEGF mRNA表达。 二、静脉移植的MSCs修复大鼠缺血脑损伤的机制研究 (一) MSCs尾静脉移植后在体内的分布将鱼线从左侧颈外动脉穿入大脑中动脉末端制备永久性脑缺血大鼠模型。术后24小时从大鼠尾静脉移植BrdU标记的MSCs，并于移植后1、3、7和14天分别采用免疫组织化学的方法观察MSCs在体内的分布；利用免疫荧光的方法检测MSCs的存活。实验数据提示：移植到脑内的骨髓间质干细胞在移植后1天主要分布在损伤侧下丘脑腹内侧的组织间质中；在第3天沿着损伤侧的丘脑，通过第三脑室进入海马的CA1(cornu ammonis 1，CA1)区，然后穿过胼胝体进入损伤的皮质区域；在细胞移植后7天，皮质缺血周边区域和海马观察到BrdU阳性细胞对Capase-3呈免疫反应阳性；在第14天全脑没有检测到BrdU特异的阳性细胞。在第7和14天，肝、肺和肾的实质组织中都能发现移植的MSCs存活。 (二) MSCs具有抑制缺血脑内神经细胞凋亡的作用 缺血后1天，将1×10<6>个MSCs经大鼠尾静脉注入大鼠体内；对照组采用PBS静脉移植。于大鼠脑缺血前，细胞移植后1、7、14及28天分别采用mNSS评分方法和HE染色分别检测成体大鼠神经功能障碍程度和神经病理损害；利用末端标记法测定MSCs对细胞移植后7、14和28天大鼠脑海马、皮质和丘脑神经细胞凋亡的情况，利用免疫荧光双标方法检测神经细胞凋亡发生机制。实验数据提示：与PBS对照组相比，MSCs在移植后14和28天能显著改善神经功能评分但不能改善神经病理表现；移植后14天大鼠脑海马、皮质和丘脑的细胞凋亡数明显减少。 (三) MSCs具有促进pax6阳性细胞存活的作用 采用免疫单标和双标方法检测成体大鼠pax6阳性细胞存活、迁移和分化的情况。尾静脉移植MSCs后，分别于移植后7和14天观察大鼠pax6阳性细胞存活情况。结果发现：移植后7天，大鼠缺血脑的皮质区域pax6阳性细胞明显增多，而移植后14天，大鼠缺血脑的皮质和海马区域pax6阳性细胞于都明显增多；移植后14天，在缺血鼠大脑的海马和皮质观察到较多的pax6+NF200，pax6+GFAP和pax6+DCX免疫双标的细胞。 结论： 1 MSCs在缺氧条件培养下能促进自身VEGF表达；MSCs移植后能促进缺血脑皮质组织VEGF表达。 2 MSCs能减少缺血脑皮质、海马和丘脑区域内的神经细胞凋亡，表明MSCs有一定的抑制神经细胞凋亡的作用。 3 MSCs可显著增加缺血脑皮质和海马区域内的pax6阳性细胞数量，同时pax6阳性细胞呈DCX、NF200、GFAP阳性表达，表明MSCs能促进大鼠缺血脑内pax6阳性细胞存活并且pax6阳性细胞向损伤区迁移并分化为神经细胞。 4 MSCs抑制神经细胞凋亡和促进pax6阳性细胞存活，提示，可能与促进缺血脑皮质组织VEGF表达有关。