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第一部分骨肉瘤细胞中KDM5C与有丝分裂期纺锤体组装检查点关系的研究 目的： 骨肉瘤是骨科疾病中最常见的原发恶性骨肿瘤。目前最常用的骨肉瘤化疗药物多柔比星、异环磷酰胺、顺铂均为非细胞周期依赖的化疗药物，具有较严重的毒副作用。因此针对细胞周期调控靶点的新型化疗药物是骨肉瘤研究的重要方向之一。 纺锤体组装检查点（spindle assembly checkpoint，SAC）作为有丝分裂期的关键调控之一，其活性能够被着丝粒附近组蛋白H3第4位赖氨酸残基的甲基化（histoneH3 lysine4 mono-/di-/trimethylation，H3K4me/me2/me3）抑制，从而促进有丝分裂期细胞从中期向后期的转化，加速细胞周期进程、增加遗传不稳定性。赖氨酸去甲基化酶5C（lysine demethylase5C，KDM5C），能够特异性催化H3K4me2/me3的去甲基化，调节染色体上H3K4me2/me3的水平。KDM5C与多种肿瘤相关，但KDM5C与骨肉瘤的关系，尤其是其对有丝分裂期纺锤体组装检查点的影响尚不清楚。 本文拟通过对多种骨肉瘤细胞系的细胞周期同步化，探讨KDM5C在骨肉瘤细胞有丝分裂期的变化及其对SAC的调控。 方法： 利用细胞周期同步化方法，收集不同骨肉瘤细胞系有丝分裂期各时间节点的细胞样品，利用Western blot检测各时间点KDM5C蛋白质含量的变化及其翻译后修饰与有丝分裂期进程的关系；并用特异性抑制剂CPI-455抑制KDM5C的去甲基化转移酶活性，利用Western blot检测有丝分裂期进程中抑制KDM5C的去甲基化酶活性对SAC相关标志蛋白细胞分裂周期蛋白-27(cell division cycle protein27，cdc27)、周期蛋白B1(Cyclin B1)的影响。 结果： 1.在骨肉瘤细胞有丝分裂进程中，与SAC相关的标志蛋白cdc27的磷酸化滞后条带的位移变化和Cyclin B1的蛋白降解均与文献报道相似，但KDM5C蛋白含量无明显变化。 2.在宫颈癌细胞HeLa中重复文献实验，但在有丝分裂前中期到G1早期中未观察到KDM5C蛋白水平的明显变化。 3.为观察KDM5C翻译后修饰所构建的重组截短体质粒，在HEK293T中表达出相应截短体蛋白质。 4.骨肉瘤细胞U2OS中检测KDM5C截短体的翻译后修饰，并未观察到明显的位移减慢或泛素化降解条带。 5.增加KDM5C去甲基化酶含量或抑制其酶活性，相较对照组， SAC相关标志蛋白cdc27的去磷酸化曲线和Cyclin B1降解曲线未见明显变化。 6.活细胞实时荧光共聚焦成像结果显示，相对DMSO对照组，抑制KDM5C酶活性后，SAC相关的有丝分裂中期向后期进程和染色体分离错误比例无明显差异。 结论： 在骨肉瘤细胞系有丝分裂期中，KDM5C的蛋白质含量不随有丝分裂期进程而改变，抑制其去甲基化酶活性不影响对SAC的灭活。 第二部分抑制KDM5C的去甲基化酶活性对小鼠成肌细胞C2C12增殖、分化的影响 目的： 骨骼肌损伤是运动医学中常见的损伤之一，损伤后易导致肌肉组织血肿机化、瘢痕修复，从而降低骨骼肌的收缩能力，并增加再次损伤的可能，对患者的运动能力构成了潜在威胁。因此探讨影响成肌分化的机制将有助于为此类骨骼肌损伤疾病提供更好的治疗方案。 H3K4的甲基化与去甲基化能够通过调节靶基因表达，调控多种重要的生物学活动。赖氨酸甲基化转移酶2D(Lysine methyltransferase2D, KTM2D)属于KTM2甲基化酶家族成员之一，能够特异性催化H3K4的单甲基化和二甲基化，小鼠中敲除KTM2D将使成肌分化标志蛋白Myogenin（MyoG）、Myosin表达缺陷，进而出现骨骼肌发育障碍，导致新生小鼠的死亡。目前已知H3K4甲基化水平主要由甲基化酶KTM2家族和去甲基化酶KDM5家族的共同调节，KDM5C作为去甲基化酶家族KDM5成员之一，具有特异性催化H3K4me3/me2的去甲基化功能，其是否参与调节成肌分化过程仍不清楚。 本研究拟通过使用KDM5C的特异性抑制剂CPI-455抑制其去甲基转移酶活性，分析KDM5C酶活性抑制后对小鼠成肌细胞C2C12增殖、分化的影响。 方法 采用特异性抑制剂CPI-455抑制KDM5C酶活性后，利用Western blot和RT-PCR分别检测成肌细胞分化0h、48h、72h、96h成肌分化标志分子的蛋白质和mRNA表达情况。通过CCK-8、Hoechst33342活细胞核染色计数检测KDM5C酶活性抑制对小鼠成肌细胞增殖的影响。 结果 1.CPI-455处理组分化48h、72h、96h成肌分化标志分子 Myosin和MyoG蛋白表达量均低于同期DMSO处理组，但成肌分化标志分子Actin, Alpha1(ACTA1)的蛋白表达量则无明显差异。CPI-455处理组的H3K4me3和KDM5C的蛋白表达量均高于同期DMSO处理组。 2.CPI-455处理组分化48h、72h、96h成肌分化标志分子Myosin、MyoG、ACTA1、MyoD、Myf5、Pax7的mRNA相对表达量相较DMSO处理组均无明显变化。 3.CPI-455处理组相较DMSO处理组KDM5C的mRNA相对表达量无明显变化。 4.CCK-8法、Hoechst33342活细胞核染色计数法检测C2C12细胞增殖实验中CPI-455处理组相较DMSO处理组的相对细胞活性或相对细胞核数均无明显差异。 结论： 抑制KDM5C的去甲基化酶活性可通过下调成肌分化标志分子Myosin和MyoG的蛋白表达影响C2C12细胞成肌分化，而对C2C12细胞增殖无明显影响。