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猪传染性胃肠炎(Transmissible Gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus,TGEV)引起的急性、高度接触性肠道疾病,以仔猪呕吐、水样腹泻和脱水为主要特征,是引发规模化猪场病毒性腹泻的主要病原之一,不同品种和不同日龄的猪只均易感染,但2日龄内的仔猪死亡率最高。成猪死亡率虽低,但会提高料肉比,增加饲养成本,给养殖业造成了巨大的经济损失。该病于1946年在美国首次报道,此后迅速在许多国家发生和流行,我国在二十世纪60年代首次在台湾地区发现该病,随后陆续在大陆数省发现该病存在,近年来其危害程度日趋加深,严重影响了我国的养殖业的发展。所以研究该病的流行与变异情况,并建立一种快速、灵敏、准确的检测方法是十分有必要的。本研究利用PK-15细胞从华南地区某猪场腹泻仔猪小肠病料中分离、鉴定为猪传染性胃肠炎病毒,并命名为TGEV CN12株。该病毒经PK-15细胞系体外连续培养至120代,并对CN12株F5与F80两代次进行全基因组序列的测定,利用生物软件对测序结果进行处理与分析,为以后开展该病毒在致病性、诊断防控以及分子生物学方面的研究提供了一定的参考依据。病毒分离鉴定结果显示:CN12株在盲传3代后开始出现比较明显的细胞病变,随着代次的增加,CPE出现时间缩短并趋于稳定。测定其F5、F20、F40、F60、F80、F100、F120七个代次的TCID50分别为10-4.25/0.1mL、10-5.23/0.1mL、10-5.67/0.1mL、10-5.89/0.1mL、10-6.67/0.1mL、10-7.33/0.1mL、10-7.26/0.1mL。序列分析发现:与国内外TGEV参考毒株比较分析发现,CN12株在ORF3a基因上存在140个连续碱基的缺失,与华毒株(疫苗株)有明显区分,可确定本分离毒株为野毒株,但它与华毒株H以及Miller株同源性较高,系统进化树显示亲缘关系较近。与F5代次相比,CN12株F80在全基因组上并未发现任何的插入、缺失等现象,只存在6个核苷酸的突变并导致4个氨基酸变异。为了建立一种针对TGEV的快速、精确、敏感、简便的检测方法,本研究参考国内外最新检测技术研究的进展,设计一对TGEV S基因上的保守区引物,通过不断的优化反应条件,初步建立了一套完善的TGEV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,标准曲线线性方程式为Ct=-3.279 lgx+37.920,其中,R2=0.99845,E=1.02,表明试验可信度高,反应体系较好;熔解曲线的Tm值83.5~84.0℃之间,峰图较为单一,并无非特异性扩增产物的出现,表明本方法特异性比较高;特异性试验结果显示,只有TGEV出现荧光信号并呈现良好的扩增曲线,表明此方法特异性较好;本次试验可以检出的最低模板拷贝数达到25 copies/μL,比常规RT-PCR敏感度高约100倍;批内和批间重复试验结果显示的CV值均小于3%,表明本方法误差小,重复性高;临床样品的检测中,本方法检出的阳性率高于常规的PCR方法。因此,相较于传统的RT-PCR方法,利用本方法检测TGEV具有用时较短、特异性强、灵敏度高、重复性好和可定量分析优点,提高了检测效率,为TGEV的临床诊断提供很大便利。