1.背景:松萝酸是天然紫外吸收剂,具有左旋或右旋对映异构体的双苯并呋喃母核的化学结构,由德国科学家W.Knop于1844年成功从地衣植物中提取分离所得。在《神农本草经》中,中药松萝被列为中品,可治“嗔怒邪气,止虚汗头风,女子阴寒肿痛”。在现代工业应用中,松萝酸可用于化妆品、个人卫生用品、减肥或保健制品。但2001年前后,美国食品及药品管理局公报多宗因服食含松萝酸钠的减肥产品（Lipokinetix）而引起严重的肝中毒事件,因而备受关注。过去研究指出松萝酸有氧化磷酸化解偶联作用,并且影响能量合成、导致代谢失调、破坏呼吸链等毒副作用。此外,也有研究证实松萝酸可引发接触性皮炎。虽然近十多年来已经发现不少新的松萝酸衍生物及新治疗作用,然而,因缺乏毒性评价而尚未被大量开发。2.目的:本课题目的主要有三个:（1）研究（+）-松萝酸肝毒性的作用机理;（2）以光降解松萝酸,分离、纯化及鉴定松萝酸光降解产物;（3）评价分离纯化所得的松萝酸光降解化合物在人肝L02细胞、表皮黑色素细胞及表皮角质细胞的毒性及紫外辐照保护作用。为新药研发及应用（如化妆品、个人卫生用品、保健品等）提供思路及基础依据。3.方法:（1）（+）-松萝酸的肝毒性作用机理研究:通过体内动物实验和体外肝L02细胞实验的研究,应用比色法、Hoechst/PI双染色法、H＆E病理切片、赖氏Reitman-Frankel法、WST-1法、蛋白免疫印迹技术、si RNA转染等不同技术手段检测及评价细胞活性、凋亡检测、肝组织病态、各种肝酶及抗氧化相关酶（包括ALT、AST、SOD、CATALASE、GSR、GST、GPx4）活力/蛋白表达、细胞分子（如TBIL、GSH、MDA等）含量、LDH释放情况、不同信号通路（如JNK、caspase-1、caspase-3等）和孔道形成蛋白如消皮素D（gasdermin-D）及前细胞胀亡受体诱导膜损伤蛋白（porimin）的影响等,评价非酶抗氧化GSH及抗氧化相关酶的水平。此外,通过药物相互作用实验评价抗氧化剂、caspase-1抑制剂及porimin si RNA转染对保护肝L02细胞免被松萝酸伤害的情况,评价porimin及caspase-1在松萝酸引致肝细胞死亡的角色。（2）松萝酸光降解产物的分离及鉴定:松萝酸-甲醇溶液光照21天,HPLC确定松萝酸已完全降解,采用薄层色谱法、硅胶柱层析法分离光降解化合物,再以制备液相纯化,通过综合分析各个化合物的质谱、~1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC、DEPT、红外光谱（IR）、X射线晶体学分析（X-ray）、旋光度（OR）或电子圆二色谱（ECD）数据,鉴定化合物的分子式及结构。（3）松萝酸光降解产物的毒性及紫外辐照保护作用:通过人肝L02细胞、表皮黑色素细胞及表皮角质细胞实验评价（+）-松萝酸及光降解产物的毒性。应用MTT法检测松萝酸及其降解化合物的细胞活性。运用Hoechst33342/PI双染色法检测紫外A或紫外B对给药后细胞的死亡率,评价各化合物的紫外辐射保护作用;此外,评价各化合物刺激tyrosinase和granulysin蛋白表达的情况,从而筛选具备安全性及抗紫外作用的化合物,为开发新药提供基础数据。4.结果:（1）（+）-松萝酸对肝L02细胞毒性的作用机理:实验证明给ICR小鼠200–400 mg/kg松萝酸（8 h）对ALT、AST和TBIL无显著影响,但H＆E病理染色肝切片分析显示肝细胞呈肿胀,细胞核糊模,细胞质泡化。体外实验确定松萝酸引起肝细胞毒性呈剂量及时间依赖性;（+）-松萝酸在肝细胞的IC50为24.4μM。Hoechst33342/PI双染检测结果证明（+）-松萝酸导致细胞坏死而与凋亡无关。实验结果显示松萝酸诱发ROS增加,GSH减少,氧化应激增加,SOD活力没有改变,GSR、GST和GPx4抗氧化相关酶的表达增加,而catalase酶蛋白表达减少,加上MDA增加,反映脂质过氧化反应增加。另一方面,25μM（+）-松萝酸对Caspase-3和cleaved caspase-3表达没有影响,但增加Caspase-1表达,cleaved caspase-1表达没有影响,推测有增加促成细胞因子成熟和分泌的趋势,从而诱导炎症。然而,进一步实验验证加入抗氧化剂（GSH）或Caspase-1抑制剂（VX-765）或二者同时联用,对暴露于（+）-松萝酸的L02细胞活性虽稍有增加,但并未能完全消除或逆转肝细胞大量死亡。免疫印迹技术实验结果证实（+）-松萝酸减少消皮素D的表达和活力,但引发前胀亡受体诱导膜损伤受体（PORIMIN）蛋白表达显著增加,在PORIMIN基因沉默的L02细胞模型中加入不同剂量（25、75或100μM）（+）-松萝酸（18 h）,细胞活性均保持在96%以上,与正常细胞相比,无差异;与松萝酸组的正常L02细胞组的细胞活性相比显著增加（p＜.01）。此外,Caspase-1抑制及PORIMIN基因沉默的L02细胞模型中加入不同剂量（25、75或100μM）（+）-松萝酸（18 h）,随剂量增加细胞活性有下降趋势,在100μM（+）-松萝酸剂量组的细胞活性显著比caspase-1未被抑制的PORIMIN基因沉默的L02细胞为低,显示caspase-1具有对（+）-松夢酸诱发肝细胞毒性的保护性。结果表明（+）-松萝酸引起肝细胞毒性的主要原因是其引致细胞胀亡。（2）松萝酸光降解产物的鉴定:成功分离、纯化及鉴定松萝酸降解得出5个化合物（1至5）,其中化合物2和5为新化合物,2是苯甲酸衍生物:2-乙基环戊烷酯-1-甲醇-3-酰-4-甲氧基-6,7-甲基-5-苯甲酸。化合物5是萘衍生物:2,4,6-三醇萘-8-甲氧基-2,4,6-三醋酸酯。而化合物1、3和4为已知化合物,化合物1是4-异苯并呋喃羧酸,1,3-二氢-7-甲氧基-3-羰基。化合物3是2-苯并呋喃乙酸,7-乙酰基-4,6-二羟基-3,5-二甲基,甲酯。化合物4是乙酮1,1’-（2,4,6-三羟基-5-甲基-1,3-亚苯基）双。（3）（+）-松萝酸及光降解产物的毒性及紫外辐照保护作用:结果显示化合物2至5在不同细胞的IC50均比松萝酸大,即毒性显著较低。在生物活性方面,紫外A及紫外B光照实验结果显示（+）-松萝酸及化合物2、3、4和5均有紫外A及B辐照保护,与空白对照组比较,有显著差异。然而,（+）-松萝酸对皮肤角质细胞的granulysin蛋白表达增加,有剂量依赖性。化合物2可显著增加granulysin的表达,3、4和5的granulysin表达与空白对照组相比无差异。5.结论:ICR小鼠实验结果证实（+）-松萝酸单次给药200–400 mg/kg对ALT、AST和TBIL血含量无影响,但在显微镜下观察肝切片呈细胞肿胀,细胞变圆变大,细胞核模糊不清,细胞质泡化,明显有炎症及肝细胞损伤。人肝L02细胞实验证实（+）松萝酸有毒性,可诱导ROS增加,GSH消耗,氧化应激增加,虽然GSR、GST和GPx4蛋白表达增加,但catalase表达降低,过氧化氢积累,MDA增加,反映脂质过氧化反应增加,诱导膜孔生成,膜渗透性增加。同时,（+）-松萝酸诱发Caspase-1的表达増加,对cleaved caspase-1、caspase-3私cleaved caspase-3表达没有影响,并且caspase-1抑制剂并未能防止或逆转大量细胞死亡。此外,（+）-松萝酸减少gasdermin-D和cleaved gasdermin-D的表达,没发现（+）-松萝酸引发细胞焦亡的情况。然而,Porimin基因沉默可防止（+）-松萝酸诱导L02肝细胞死亡。在氧化应激及脂质过氧化的条件下,松萝酸怎样导致PORIMIN受体的激活引致细胞胀亡的完整过程,有待进一步研究。总结,（+）-松萝酸引致肝中毒的主要机制是细胞胀亡。本课题实验成功分离、纯化及鉴定出5个松萝酸（在甲醇溶液中）光降解化合物（1至5）。其中,化合物2和5为新化合物,分别名为2-乙基环戊烷酯-1-甲醇-3-酰-4-甲氧基-6,7-甲基-5-苯甲酸和2,4,6-三醇萘-8-甲氧基-2,4,6-三醋酸酯。化合物2、3、4和5于肝L02细胞、黑色素细胞及表皮角质细胞的IC50显著较低（p＜.001）,毒性比松萝酸显著较小。化合物4和5对表皮角质细胞的granulysin活力无影响。在紫外辐射活性实验中,2、3、4和5均有紫外A或B辐射保护作用。综合紫外A/B辐射保护作用及安全性评价,虽然化合物3在三种受试细胞的毒性最低,但抗紫外作用较松萝酸稍差。虽然化合物4的紫外辐照保护作用与（+）-松萝酸大致相同,但其细胞毒性比3或5大。实验结果证实化合物3、4和5肝细胞毒性较松萝酸低,不刺激granulysin蛋白增加,皮肤毒副作用发生率较低,而且化合物3、4和5具有不同程度的紫外A和紫外B辐照保护作用。结论,化合物3、4和5是具有发展潜力的紫外防护剂。而2、3、4和5在其它方面的应用需进一步研究。本课题的研究结果对后续科研及开发具实用意义。