背景与目的：　　 聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction,PCR)是一种核酸体外扩增技术,作为最基础的分子生物学技术之一,PCR被普遍应用于许多研究领域。尤其随着PCR技术与其他分析技术的联合应用,更加使得PCR技术越来越广泛地渗透到分子生物学研究的诸多领域及学科,并大大加速了各相关领域的研究进程。虽然各种类型PCR技术的基本反应原理都大致相同,但在实践中我们经常会遇到难以扩增的DNA目标序列,尤其相对于非高GC含量DNA序列而言,高GC含量DNA序列的PCR扩增更是困难。虽然高GC含量DNA序列在人类基因组中只占大约3％,但其范围覆盖了包括启动子、增强子和其它控制元件在内的大多数重要调控区域；大多数看家基因、抑癌基因和约40％的组织特异性基因的启动子区域也由高GC含量DNA序列组成。这些DNA序列因其高GC含量导致针对它们而设计的PCR低效或无效扩增现象,必然阻碍了各个领域对针这些基因的相关研究进程。　　 目前普遍认为,由高GC含量DNA模板和/或引物的自身互补或其它构象特征所引起的二级结构,如环状结构或发夹结构等,是导致PCR无效扩增的主要原因。　　 为了解决高GC含量DNA序列PCR扩增效率低的问题,目前最普遍的做法是在PCR扩增体系中加入一种或数种包括甜菜碱、二甲基亚砜、甲酰胺、聚乙烯、非离子型去污剂、7-脱氮-2-脱氧鸟苷三磷酸和尿苷三磷酸等在内的PCR增效添加剂,或者同时使用AmpliTaqTM,Taq GoldTM,KOD热启动酶,Optimase DNA聚合酶,Platinum(R)Taq DNA聚合酶等高效DNA聚合酶。另外,应用NaOH对DNA模板进行预变性、Hot Start PCR、Stepdown PCR和Slowdown PCR等技术也有助于提高高GC含量DNA序列的PCR扩增效率。同时调节Mg2+浓度、缓冲液pH值、变性温度与时间、退火温度与时间和PCR循环次数等参数在某些情况下也显得十分必要。　　 我们在详细分析了不同因素对PCR扩增效率的影响后,认为其中引物设计是最为关键性的因素。在PCR扩增之前,精确的引物设计和分析,尤其是对引物自身二聚体(self-dimers)、发夹结构(hairpins)和引物对之间二聚体(cross-dimers)等引物二级结构的分析是十分必要的。同时我们发现诸多文献中报道的高GC含量DNA序列扩增引物都存在着相同的缺陷,如:解链温度(melting temperature,Tm)过低、引物对之间解链温度差值(ΔTm)过高或者引物与DNA模板多个位点存在错配等。这些问题会引起引物与DNA模板之间退火失败或者在模板的多个位点退火,进一步导致PCR无效扩增或者出现诸多非特异性扩增。因此我们分析,这些引物缺陷可能是导致PCR无效扩增的主要问题,由此,我们认为通过优化高GC含量DNA序列的PCR扩增引物,建立有效的引物设计方案,应该是解决高GC含量DNA模板PCR无效、低效和非特异扩增最简易、便捷、低耗和高效的途径。　　 本研究基于上述分析结果,针对引物设计中一些突出问题进行优化,建立了一种以高Tm值和低引物对ΔTm差值为基础的特异性引物设计策略。根据这一设计策略,我们设计了15对特异性引物用于高GC含量DNA序列的PCR扩增,同时配合PCR反应体系的优化,成功实现了应用普通Taq DNA聚合酶和普通PCR循环条件对15个高GC含量DNA模板的特异性扩增。对照实验也同时验证了我们这一策略的可行性。同时应用上述策略,针对26个非高GC含量DNA模板进行引物设计,结果所有26个扩增子在统一的PCR条件下,也全部成功的获得了特异性扩增产物。因此该引物设计策略在非高GC含量DNA序列PCR扩增中也具有普遍实用性,同时还有助于多片段扩增时PCR体系和循环参数的高度统一。本研究为解决高GC含量DNA序列PCR扩增问题提供了简便、低成本和高效的解决方案,而且也普遍适用于普通模板的PCR扩增。同时,本研究对不同扩增子序列在相同PCR反应条件进行扩增从而实现PCR技术的高通量提供了技术支持。另外,本研究结果表明,引起高GC含量DNA序列PCR无效扩增的主要原因可能不是DNA或者引物序列的二级结构,而是由于引物设计问题导致的引物退火不同步。　　 材料与方法：　　 1.DNA模板　　 本研究共选用了15个高GC含量和26个非高GC含量DNA模板序列作为研究对象。15个高GC含量DNA模板序列分别来自8个基因:HBA2(NC000016.9)、FMR1(NC_000023.10)、APOE(NC_000019.9)、HRES1(NC_000001.9)、CSTB(NC_000021.8)、INSR(NC_000019.9)、AR(NC_000023.10)和GATA4(NC_000008.10),其GC含量为66.0％-84.0％。26个非高GC含量DNA模板序列分别来自位于Xq28上FⅧ基因的26个外显子,其GC含量为35.2％-53.5％。(上述基因序列均来自于http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)采用经典的酚-氯仿法从人白细胞中提取基因组DNA。　　 2.引物设计与优化　　 15对高GC含量DNA序列PCR扩增的特异性引物全部由手工设计完成,在保证与DNA模板序列互补的前提下,为了使引物具有较高的Tm值和较低的引物对△Tm差值,我们在每条引物的5’或3’端加入或去掉了一个或数个碱基。同时设计了26对非高GC含量DNA序列PCR扩增的特异性引物,以验证该引物设计策略在非高GC含量DNA序列PCR扩增中的实用性。PCR产物的GC含量以及包括Tm值,△Tm差值,引物自身二聚体、引物对之间二聚体和发夹结构的最大自由能差AG等在内的引物参数由Oligo6.64软件(Molecular Biology Insights,Inc.,CO)计算得到。　　 我们同时又合成了两组引物作为对照实验。一组是将本研究中已设计好的用于高GC含量DNA模板PCR扩增的15对引物,在5’端分别去除2个碱基,称为截短引物,目的是验证高GC含量DNA模板引物设计中高Tm值的必要性；另一组是相关文献中15条高GC含量DNA模板的PCR扩增引物。这两组引物与我们设计的引物用相同的PCR条件,即不添加增效剂和不使用特殊PCR方法,而用普通TaqDNA聚合酶和普通PCR循环条件对其进行扩增,以对照这些PCR引物与本研究中设计的15对引物的扩增效率。所有引物由INVITROGEN公司(Guangzhou,China)合成。　　 3.PCR体系与扩增条件　　 所有PCR反应体系组成均为:50μl的总反应体积中,包含50-200ng人类基因组DNA,上、下游引物各0.2μM,四种dNTP各50μM,2.0U Taq DNA聚合酶和5μl10×PCR buffer(含100 mM Tris-HCl,500mM KCl和15mM MgCl2,pH8.3。大连Takara公司)。　　 所有PCR扩增反应均在美国PE公司的9700型热循环仪上进行。本研究设计的针对15个高GC含量DNA模板扩增引物的PCR反应条件为:96℃预变性5min,35个PCR循环中,96℃变性45sec,退火温度、时间和72℃延伸时间则因引物和模板的GC含量及长度不同而分别作了相应调整,最后在72℃后延伸10min。26个非高GC含量DNA模板扩增的条件统一为:95℃预变性5min,94℃变性30sec,59℃退火30sec,72℃延伸1min,共30个循环；最后在72℃延伸10min。　　 引用文献的15对引物的PCR反应体系和扩增条件与本研究中设计的15对高GC含量DNA模板扩增引物相同。　　 5’端减少2个碱基的15对截短引物扩增条件为95℃预变性5min,96℃变性45sec后,分别在58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃和65℃退火,退火时间和72℃延伸时间与本研究中设计的15对引物的条件相同,共35个循环,后延伸为72℃10min。　　 PCR扩增产物5μl加1μl溴乙锭染色上样缓冲液,在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分析,电压80V,时间50分钟,以鉴定PCR扩增的特异性。　　 4.统计分析　　 本研究15对用于高GC含量DNA序列PCR扩增引物的参数与文献中15对高GC含量PCR扩增引物的各项参数进行独立样本t检验,所使用统计学软件为SPSS13.0软件(SPSS Inc,Chicago,USA)。　　 结果与讨论：　　 1.PCR扩增结果　　 1.1应用本研究中设计的15对引物对15个高GC含量DNA序列进行PCR扩增的结果　　 在不使用任何增效剂以及touch-down PCR等特殊PCR技术,而仅仅使用普通Tag DNA聚合酶和普通PCR循环条件,对15个高GC含量DNA序列进行了成功扩增。　　 1.2应用文献中15对引物对15个高GC含量DNA序列进行PCR扩增的结果　　 在不使用任何增效剂以及touch-down PCR等特殊PCR技术,而仅仅使用普通Tag DNA聚合酶和普通PCR循环条件,对15个高GC含量DNA序列进行扩增,结果显示为大量非特异扩增或无效扩增。　　 1.3应用15对截短引物对15个高GC含量DNA序列进行PCR扩增的结果　　 在不使用任何增效剂以及touch-down PCR等特殊PCR技术,而仅仅使用普通Tag DNA聚合酶和普通PCR循环条件,对15个高GC含量DNA序列进行扩增,结果显示为大量非特异扩增或无效扩增。　　 2.本研究所用引物与文献中引物参数和PCR产物GC含量的统计分析　　 通过t检验,对本研究所用引物与文献中引物参数进行统计分析,可以得到以下结果:两组引物的Tm值(t=2.643,P=0.007)和引物对的△Tm差值(t=-3.181,P=0.000)之间的差异存在统计学意义,引物自身二聚体、引物对之间二聚体和发夹结构的最大自由能差ΔG之间的差异不存在统计学意义。　　 对两组实验中的PCR产物GC含量进行统计分析,结果显示也不存在统计学意义。　　 3.26对非高GC含量引物PCR扩增结果　　 应用本研究中建立的引物设计方案,针对FⅧ基因26个外显子进行了特异性引物设计,并应用普通Taq DNA聚合酶和普通PCR循环条件对其进行PCR扩增,扩增产物的电泳结果显示,FⅧ基因26个外显子的PCR扩增产物条带特异,扩增成功。　　 4.讨论　　 目前普遍认为,高GC含量引物和DNA模板易于形成二级结构,二级结构的形成可以同时阻碍PCR扩增过程中的变性、退火和延伸三个步骤,因此引物自身、引物与模板、模板自身二级结构的形成被一致认为是导致高GC含量DNA模板PCR无效、低效扩增的主要原因。基于这一观点,很多旨在降低DNA模板双链稳定性的方法被用来解决这一技术问题,如在PCR扩增体系中加入一种或多种有机添加剂,使其与DNA中的鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)形成氢键,从而减少DNA分子内或分子间G和C形成的氢键,破坏由G和C间氢键形成的DNA分子二级或三级结构。虽然这些有机化合物对提高一些高GC含量DNA模板的扩增效率有确切的效果,但在实际操作中其效率并不确定。表现为:不同的添加剂对GC含量不同的模板,提高扩增效率的效果也有所不同,因此会发生对某个高GC含量DNA模板扩增有帮助的增效剂,放入另一高GC含量DNA模板的PCR体系中,对其扩增并无任何帮助的情况。即,不同模板在进行PCR扩增时,需在多种增效剂中筛选各自适当的增效剂,这就使得这一方法用于提高高GC含量DNA模板的PCR扩增过程变得非常繁琐。其次,增效剂的作用也不具备普遍适用性,某些高GC含量DNA模板,即使在筛选了大量增效剂后,仍然无法找到合适的增效剂来解决其PCR扩增失败的情况。且有时即使使用增效剂,还要同时配合使用昂贵的高效DNA聚合酶才能发挥作用,从而大大提高了PCR的成本。　　 针对上述这些情况,人们还选用了其他一些手段,如Hot Start PCR、Stelpdown　　 PCR和Slowdown PCR等技术也有助于提高高GC含量DNA模板的PCR扩增效率。此外,使用NaOH对DNA模板进行预变性、调节Mg2+浓度、缓冲液pH值、变性温度与时间、退火温度与时间和PCR循环次数等等手段,也都对提高高GC含量DNA模板的PCR扩增效率有一定帮助。　　 所有上述这些优化方法的主要目的都是降低复杂二级结构的稳定性,进而提高模板变性、引物退火和延伸反应的效率。这些方法不但耗时、费力、成本高,还缺乏普遍适用性,即它们都只能对部分高GC含量DNA序列的PCR扩增有用,而不能解决所有高GC含量DNA序列的PCR扩增问题。且这些方法通常需要互相组合、同时应用才有效果,使PCR条件的优化消耗大量的时间和精力。同时这些方法都有很大的局限性,即它们主要针对高GC含量的DNA模板,一旦将其应用于非高GC含量的一些其他普通模板,反而会出现完全无效扩增的现象。　　 一个PCR扩增循环一般由DNA模板变性,引物退火和引物延伸等三个步骤组成。通常情况下,引物退火问题是导致PCR扩增失败的最主要原因,因此,引物属性对于PCR扩增,尤其是对于高GC含量DNA序列的PCR扩增十分重要。但我们发现,绝大多数文献在引物设计时都是重点避免了各种引物二级结构的形成,而对于如何调整引物的其它参数却较少提及。　　 理论上,因高GC含量DNA双链完全解开所需温度明显比一般的DNA双链高,而当退火温度较低时,模板的两条单链有较快复性的趋势,可与引物退火相互竞争。因此,扩增高GC含量DNA序列需要较高的退火温度,这样有助于引物退火,从而提高扩增效率。我们尝试使用文献中同时具有较高Tm值和较高ΔTm差值的引物对在较低的退火温度下进行PCR扩增,结果扩增全部失败了。分析其失败原因,可能存在以下两种情况:—①高GC含量DNA模板变性后,两条具有高Tm值的DNA单链可能在引物退火之前相互复性,从而阻碍引物与模板的退火。②即使引物与模板退火成功,高GC含量DNA模板的两条变性单链可能因局部复性而阻碍了引物的延伸。上述原因都将导致无效或低效的PCR扩增。于是我们改变扩增条件,使用较高的退火温度进行PCR扩增,但是同样全部失败了。分析其原因:①引物对中Tm值较低的引物可能会成功退火,但是另一条Tm值较高的引物可能会在高GC含量DNA模板的多个位点退火,导致该引物被大量消耗。②在引物对中Tm值较高的引物可以正确退火的条件下,另一条Tm值较低的引物可能不能退火。这两种原因都将引起引物退火不同步,并导致无效或非特异性扩增。基于上述分析,我们认为具有高Tm值和低ΔTm差值的引物对,对于扩增高GC含量DNA序列应该是有效的。　　 基于以上思路,本研究设计了15对用于扩增高GC含量DNA序列的引物,在不使用任何PCR增效剂和高效DNA聚合酶的情况下,成功的进行了PCR扩增,其产物的GC含量为66.0-84.0％。这15对引物均具有较高的Tm值(83.1167±3.5254℃)和较低的△Tm差值(0.3933±0.2840℃)。统计学分析表明,本文及文献中15个DNA模板的PCR产物GC含量差异无统计学意义,这一点可以证明,高GC含量DNA序列在较高退火温度或者72℃延伸条件下,其二级结构不能形成。PCR扩增结果也表明,引物二级结构在较高的退火温度下也不能形成。因此,我们认为引起高GC含量DNA序列PCR无效扩增的原因可能并不主要是二级结构,而是引物设计问题导致的引物退火不同步。各引物参数的统计学分析表明,引物的Tm值和引物对的△Tm差值是影响高GC含量DNA序列PCR扩增的主要因素。　　 为进一步验证该引物设计策略在PCR扩增非高GC含量DNA序列中的实用性,我们根据上述引物设计策略对FⅧ基因的26个外显子设计了26对特异性引物,其PCR产物的GC含量为35.2-53.5％。为了26对引物可以在相同PCR条件下成功扩增,我们使所有引物均具有接近的Tm值(74.0788±0.4791℃)和较低的引物对ΔTm差值(0.5038±0.39950C)。相对于其PCR产物的GC含量而言,这组引物的解链温度是比较高的。电泳结果表明,本引物设计策略同样适用于非高GC含量DNA序列的PCR扩增,且对统一PCR扩增条件有相当好的实用性,并同时证明了引物设计对于PCR扩增的重要性。　　 综上所述,引物Tm值和引物对△Tm差值是除引物特异性之外影响高GC含量DNA序列PCR扩增的最重要的参数,我们的实验数据分析结果也证实了这一观点。引物具有高Tm值和低引物对ΔTm差值,可以较容易的克服高GC含量DNA序列PCR扩增中的技术困难,并在普通条件下进行成功扩增。最后,基于本研究结果,我们认为引起高GC含量DNA序列PCR无效扩增的主要原因可能是由于引物设计问题导致的引物退火不同步,而不是DNA或者引物序列的二级结构。　　 结论：　　 1.针对高GC含量DNA模板,建立了一种高解链温度(Tm)和低引物对解链温度差值(△Tm)的特异性引物设计策略。　　 2.经实验证明,本设计方案同样适用于普通序列的PCR扩增,并对统一PCR扩增条件有很好的实用性,对PCR高通量扩增有重要意义。　　 3.引起高GC含量DNA序列PCR无效扩增的主要原因可能是由于引物设计问题导致的引物退火不同步,而不是DNA或者引物序列的二级结构。