研究目的:癫痫是神经科常见慢性疾病之一,其病理生理机制复杂。近年来癫痫与神经系统炎症反应及炎性介质的关系已成为研究热点,受到广泛关注。最新研究显示,包括IL-1β在内的多种炎性介质在癫痫患者及癫痫动物模型的脑组织中表达水平升高。深入研究发现IL-1β能提高神经元兴奋性、增加痫性发作可能性。本研究通过腹腔注射氯化锂、匹罗卡品建立癫痫模型,探索能否通过腹腔IL-1β单克隆抗体中和癫痫持续状态所导致IL-1β含量异常升高,观察白介素1β(IL-1β)单克隆抗体对癫痫持续状态诱导大鼠海马组织炎症反应的影响。研究方法:72只健康成年雄性SD大鼠随机分为对照组(n=20)、癫痫模型组(模型组,n=26)、IL-1β单抗抗体治疗组(治疗组,n=26)。模型组和治疗组均采用氯化锂-匹罗卡品建立癫痫模型,对照组以相同液体量的生理盐水替代氯化锂、匹罗卡品。当模型组、治疗组大鼠痫性发作达到Racine分级的IV-V级发作且持续1小时后,腹腔注射溴化甲基阿托品和地西泮解除痫性发作。治疗组大鼠于癫痫发作30分钟、7天及14天后分别给予IL-1β单克隆抗体1ml(20ug?ml)腹腔注射,模型组和对照组则给予等量的生理盐水。模型组和治疗组分别于造模后72h、21d两个时间点随机取3只提取海马组织总蛋白,采用蛋白质印记法检测用药后72h、21d海马组织中IL-1β单克隆抗体的含量。各组大鼠于造模后72h随机取10只大鼠断头取脑、分离海马组织和进行腹主动脉抽血,用RT-PCR检测痫性发作72h后海马组织中IL-1β、NF-κB mRNA表达水平,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中S100B含量。各组于造模后21天,大鼠行心脏灌注固定,分离脑组织进行冰冻切片,行免疫荧光法检测海马区胶质细胞活化情况及行尼氏染色检测神经元凋亡情况。通过统计学分析比较IL-1β单克隆抗体对癫痫的干预是否有效。研究结果:1.在注射匹罗卡品10~40min后,模型组大鼠开始出现排便排尿、口角流涎、双眼充血等外周胆碱能反应;继之出现面部抽动、行动刻板、平衡力下降、行走不稳等表现;最后出现癫痫发作的典型症状:阵发性出现咀嚼或牙关紧闭、颈项强直或全身肌肉僵硬、湿狗样抖动、四肢不自主抽搐或痉挛,最终出现全身强直-痉挛发作并失去平衡、跌倒。模型组造模成功率85.29%,死亡率10.34%(68只大鼠,58只成功建立癫痫模型,其中4只在注射匹罗卡品后24h内死亡,2只在癫痫发作后48h内死亡,10只未出现典型的癫痫发作)。2.模型组大鼠海马组织中仅检测到少量il-1β抗体,考虑与抗体的交叉反应有关,治疗组中给药72h(3.797±0.021)、21d(3.584±0.024)后大鼠海马组织中il-1β单克隆抗体的浓度明显高于模型组(1.278±0.019、1.351±0.010)。与标准浓度比较发现不同时间点治疗组中il-1β单克隆抗体的浓度均>3.00ugab/g。结果提示:il-1β单克隆抗体能够通过血脑屏障并能保持有效治疗浓度(>3.00ugab/g)。3.模型组il-1β、nf-κb表达水平均高于对照组(均p<0.01),治疗组il-1β、nf-κb表达水平均低于模型组(均p<0.01)。4.对照组血清中s100b蛋白水平较低,与模型组比较,治疗组血清中s100b蛋白水平明显下降(p<0.01)。5.尼氏染色显示对照组ca1区、ca3区锥体细胞、神经元排列整齐,形态完整;模型组ca1区、ca3区有神经元脱失及变形、胶质细胞增生(与对照组比较,p<0.05);与模型组比较,治疗组大鼠海马ca1区、ca3区锥体细胞、神经元缺失情况显著减轻(p<0.01)。6.为进一步探讨il-1β单克隆抗体对于胶质细胞增生的影响,观察造模后第21天海马区胶质细胞增生情况,利用胶质纤维酸性蛋白(gfap)、iba1抗体进行荧光双标。免疫荧光双标染色显示,正常对照组大鼠海马无胶质细胞异常增生,se21天在海马ca3区表现为gfap与iba1阳性细胞明显增多,星形胶质细胞和小胶质细胞增生现象显著(p<0.05),差异有统计学意义。而治疗组GFAP与Iba1阳性细胞较模型组明显减少(p<0.01)。胶质细胞活化情况显著减轻(P<0.01)。结论:(1)利用氯化锂-匹罗卡品建立癫痫模型可诱导大鼠表现为典型的癫痫持续状态,模型大鼠进入慢性期后,通过尼氏染色及免疫荧光染色观察到海马CA1、CA3区出现神经元损伤、胶质细胞增生等病理改变,这些病理改变符合人难治性癫痫的典型病理改变,同时氯化锂-匹罗卡品模型的发作分期符合人类癫痫的发病特点。另外该模型实验周期短、实验条件成熟、易操作。以上证据均提示氯化锂-匹罗卡品癫痫动物模型可以作为研究癫痫发病机制、治疗方法等研究方向的重要选择之一。(2)IL-1β是最强大的促炎因子之一,其介导的信号转导途径是组织炎症反应的开始。IL-1β作为上游炎性因子能介导多种炎性因子表达上调,继而诱发下游的炎症瀑布反应,NF-κB为细胞内重要的下游信号转导介质之一,参与调节多种细胞因子的基因转录,活化的NF-κB可促进IL-1β基因转录。本实验中通过RT-PCR检测实验动物海马组织中IL-1β、NF-κB mRNA转录水平,实验结果显示:模型组IL-1β、NF-κB mRNA表达水平较正常组明显上调(p<0.05),提示癫痫诱导IL-1β、NF-kB mRNA转录、免疫炎性因子介导的炎症反应在SE中发挥重要作用。(3)S100B是血脑屏障渗漏和星形胶质细胞损伤的标志物,本实验证实在癫痫模型大鼠急性期血清中S100B水平明显高于对照组,提示癫痫发作可能导致神经元、胶质细胞损伤及血脑屏障破坏。通过腹腔注射IL-1β单克隆抗体,并检测海马组织中IL-1β单克隆抗体浓度发现其能有效通过血脑屏障。癫痫模型大鼠腹腔内注射IL-1β单克隆抗体能降低血清中S100B水平及改善神经元缺失、胶质细胞活化,这提示IL-1β参与癫痫发作造成的血脑屏障破坏及脑损伤过程。(4)以癫痫发作诱导的炎症反应为靶点将可能成为未来癫痫治疗的新方向。