论文部分内容阅读
目的:研究艳山姜挥发油(EOFAZ)对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导损伤的人主动脉内皮细胞(HAECs)的保护作用及迁移和修复的影响,探索其保护作用是否与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)与一氧化氮合酶(NOS)信号相关联,同时探索MAPK与NOS信号之间是否存在crosstalk调控,阐明EOFAZ保护作用机制,为血管内皮功能失调相关疾病的预防和治疗提供实验基础和理论指导。方法:(1)EOFAZ保护作用研究分为7组:正常对照组(control,无血清ECM),模型组(ox-LDL,200 mg/L ox-LDL),EOFAZ高剂量组(200 mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ),EOFAZ低剂量组(200 mg/L ox-LDL+10μg/L EOFAZ),阿司匹林组(Asp.,200 mg/L ox-LDL+2.5×10-4 mol/L Aspirin),卡维地洛组(Car.,200 mg/L ox-LDL+1×10-6 mol/L Carvedilol),阿托伐他汀钙组(Atov.,200 mg/L ox-LDL+1×10-6 mol/L Atorvastatin Calcium)。(2)EOFAZ对细胞迁移与修复作用研究分为4组:正常对照组(control,0.5%ECM),模型组(ox-LDL,200 mg/L ox-LDL+0.5%ECM),EOFAZ高剂量组(200 mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ+0.5%ECM),EOFAZ低剂量组(200 mg/L ox-LDL+10μg/L EOFAZ+0.5%ECM)。(3)MAPK信号研究分为5组:正常对照组(无血清ECM),模型组(200 mg/L ox-LDL),EOFAZ组(200 mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ),MAPK抑制剂组(200 mg/L ox-LDL+40μmol/LSB203580或5μmol/L SP600125或10μmol/L PD98059),EOFAZ加MAPK抑制剂组(200 mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ+40μmol/L SB203580或5μmol/L SP600125或10μmol/L PD98059)。(4)NOS信号研究分为5组:对照组(无血清ECM),模型组(200 mg/L ox-LDL),EOFAZ组(200 mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ),NOS抑制剂组(200 mg/L ox-LDL+100μmol/L L-NAME或300μmol/L L-NMMA),EOFAZ加NOS抑制剂组(200 mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ+100μmol/L L-NAME或300μmol/L L-NMMA)。(5)MAPK抑制剂Crosstalk调控NOS信号研究实验分为7组:对照组(无血清ECM),模型组(200 mg/L ox-LDL),EOFAZ组(200 mg/L ox-LDL+100μg/L EOFAZ),nos抑制剂组(200mg/lox-ldl+100μmol/ll-name或300μmol/ll-nmma),p38mapk抑制剂组(200mg/lox-ldl+40μmol/lsb203580),jnk1/2/3抑制剂组(200mg/lox-ldl+5μmol/lsp600125),erk1/2抑制剂组(200mg/lox-ldl+10μmol/lpd98059)。(6)nos抑制剂crosstalk调控mapk信号研究分为5组:对照组(无血清ecm),模型组(200mg/lox-ldl),eofaz组(200mg/lox-ldl+100μg/leofaz),mapk抑制剂组(200mg/lox-ldl+40μmol/lsb203580或5μmol/lsp600125或10μmol/lpd98059),nos抑制剂组(200mg/lox-ldl+100μmol/ll-name或300μmol/ll-nmma)。体外培养haecs,用ox-ldl复制细胞损伤模型,加入eofaz、阿司匹林、卡维地洛、阿托伐他汀钙、mapk或nos各抑制剂干预保护1h后,继续加入ox-ldl继续作用24h。采用mtt法分析细胞存活率,确定ox-ldl诱导细胞损伤的最佳浓度与时间。倒置显微镜观察细胞损伤形态,吉姆萨(giemsa)和苏木精-伊红(he)染色观察细胞损伤病理学特征。划痕试验(woundscratchassay)进行细胞迁移距离与修复分析,微孔滤膜培养小室及双室联合培养系统(transwell)分析细胞迁移率。分别用酶标仪法、elisa法分析细胞损伤的乳酸脱氢酶(ldh)和一氧化氮(no)含量。化学法检测结构型一氧化氮合酶(enos)和诱导型一氧化氮合酶(inos)含量。实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitativereal-timepolymerasechainreaction,qrt-pcr)检测p38mapk、jnk1/2/3、erk1/2、inos及enosmrna表达水平。蛋白质免疫印迹分析法(westernblot)检测p38mapk、p-p38mapk、jnk1/2/3、p-jnk1/2/3、erk1/2、p-erk1/2、inos及enos蛋白表达水平。结果:eofaz明显提高haecs损伤的细胞存活率,显著改善细胞损伤病理形态,促进细胞损伤后的迁移和修复,明显提高细胞损伤迁移率,同时能促进no及enos的产生,抑制ldh及inos的释放。qrt-pcr分析表明,eofaz以及相关抑制剂显著下调inosmrna表达水平,上调enosmrna表达水平(p<0.05),而对p38mapk、jnk1/2/3、erk1/2mrna表达无显著影响,差异无统计学意义。westernblot结果表明,eofaz以及相关抑制剂显著下调p-p38mapk、p-jnk1/2/3、p-erk1/2、和inos蛋白表达水平,上调enos蛋白表达水平(p<0.05),但对p38mapk、jnk1/2/3、erk1/2总蛋白表达无显著影响,差异无统计学意义。结论:(1)eofaz对ox-ldl诱导损伤的haecs发挥保护作用,能促进细胞损伤的迁移和修复,其保护作用机制与抑制MAPK信号p38MAPK、JNK1/2/3、ERK1/2磷酸化以及调控eNOS和iNOS的平衡失常有关。(2)ox-LDL诱导HAECs损伤过程中存在MAPK信号与NOS信号crosstalk,为临床血管功能损伤疾患的防治提供新的理论与实验基础。