目的:知黄痛风汤为我院医院制剂,本课题对知黄痛风汤进行指纹图谱研究,为后期的质量标准、药效学及作用机制研究打下基础。利用现代化药理学研究方法,制备高尿酸血症小鼠及痛风性关节炎大鼠动物模型,开展知黄痛风汤对高尿酸血症小鼠与痛风性关节炎大鼠的药效学及作用机制研究。利用高通量测序技术对高尿酸血症小鼠肾脏micro RNA进行筛选,考察知黄痛风汤对高尿酸血症小鼠肾脏micro RNA表达的影响。同时,利用基因芯片技术对痛风性关节炎大鼠关节滑膜组织m RNA进行筛选,考察知黄痛风汤作用于痛风性关节炎大鼠的靶点和机制。进行知黄痛风汤的急性毒性实验,考察其安全性,为其在临床的应用提供了参考依据。方法:(一)称取知黄痛风汤处方药材共102 g,加水1000 m L,浸泡30 min,大火煎开后转小火煎煮1h,煎煮2次,滤过,合并两次滤液,浓缩至120 m L,得生药浓度0.85 g·m L-1。利用高效液相色谱法选用合理的流动相、梯度洗脱条件、柱温、检测波长对知黄痛风汤进行指纹图谱分析。(二)高尿酸血症模型的建立:将60只昆明小鼠随机分为6组:正常组、模型组、阳性药组、知黄痛风汤高、中、低剂量组,每组10只。除正常组小鼠外,其他组小鼠均腹腔注射100mg/Kg氧嗪酸钾联合灌胃500mg/Kg次黄嘌呤制作高尿酸血症小鼠模型,造模1h后,每组小鼠均给予相应受试药物,每日一次,整个实验周期持续21天。从第8天开始,知黄痛风汤高、中、低剂量组分别灌胃31.6,15.8,7.9 g/kg的知黄痛风汤,阳性药组灌胃5 mg/kg别嘌醇,正常组和模型组给予等量的生理盐水,给药每日一次,持续14天。血清、尿液、肝脏生化指标检测:给药第20天,给药1h后,每组取6只小鼠置于代谢笼内收集24h尿液。利用全自动生化分析仪按照ELISA试剂盒说明书检测尿液中尿酸(UUA)、血清尿酸(SUA)、血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)的水平及小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶(XOD)活性。对肾脏尿酸转运蛋白表达的影响:处死小鼠,取其肾脏利用Western blot检测尿酸重吸收转运子(URAT1、GLUT9)、影响尿酸排泄的有机阴离子转运体(OAT1)、有机阳离子转运体(OCT1、OCT2)在各组小鼠肾组织中含量的变化。对高尿酸血症小鼠肾脏micro RNA表达的影响:末次给药1h后,处死老鼠,取其肾脏利用高通量测序技术对正常组、模型组、知黄痛风汤高剂量组肾脏组织micro RNA进行筛选,比较三组小鼠肾脏中micro RNA的表达差异。(三)痛风性关节炎大鼠模型建立:将60只SD大鼠随机平均分为6组,正常组、模型组、阳性药组、知黄痛风汤高、中、低剂量组,每组10只。除正常组和模型组大鼠灌胃等量的生理盐水,知黄痛风汤高、中、低剂量组分别灌胃19.3,9.6,4.8 g/Kg的知黄痛风汤,阳性药组灌胃18.88 mg/kg塞来昔布,持续9天。第7天灌胃1h后,除正常组大鼠外,其他各组均采用尿酸钠(MSU)晶体溶液(20mg/m L),每只100μL,注射于右踝关节关节腔内造模。对大鼠步态、关节及脚掌肿胀度、滑膜组织中炎症因子的影响:造模2,6,12,24,48h后,对大鼠步态进行评级并统计。给药第9天,给药1h后,处死大鼠,取其滑膜组织上清液,利用全自动生物分析仪检测白细胞介素-1β(1L-1β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)的含量。对大鼠踝关节滑膜组织m RNA表达的影响:末次给药1h后,处死大鼠,取关节滑膜组织,利用基因芯片技术检测正常组、模型组、高剂量组滑膜组织m RNA表达量的差异,建立m RNA信号网络图,选取处于网络核心位置的m RNA,利用Western blot法验证Arrb2、NLRP3在六组大鼠右踝关节滑膜组织蛋白的表达及其发挥的作用和机制。(四)知黄痛风汤的安全性评价:将80只小鼠随机分为四组,每组20只,分别为雄性给药组、雄性对照组、雌性给药组、雌性对照组。试验前禁食(不禁水)15h,给药组按知黄痛风汤给药剂量31.6g/kg,灌胃一天,一天两次,间隔不低于4小时,给药后停食3-4小时。正常组灌胃等量的生理盐水。观察小鼠形态、精神状态的变化;在第1天,第7天,第14天分别称取小鼠的体重,观察体重的变化;取其血清分析血清中生化指标水平变化;取其心、肝、脾、肺、肾组织进行病理切片,观察组织的病变情况。结果:(一)确定知黄痛风汤的检测波长为245 nm,乙腈-0.5%冰醋酸溶液(加入0.1%十二烷基磺酸钠)梯度洗脱时,峰形及峰分离效果好,峰数目也较多。通过建立指纹图谱研究,确定了知黄痛风汤中四个质控成分及其来源的单味药,同时测定了其含量,专属性强,重复性好。(二)与正常组比较,模型组小鼠血清尿酸、尿素氮水平,肝脏XOD活性均明显升高(P<0.01),别嘌呤醇和知黄痛风汤给药14天后,各组小鼠血清尿酸、尿素氮含量,肝脏XOD活性均显著下降(P<0.01);模型组小鼠较正常组小鼠尿尿酸明显减少(102.30μmol/L)(P<0.01),给药别嘌呤醇及知黄痛风汤后,高尿酸血症小鼠尿尿酸明显增多,且嘌呤醇增加尿酸高尿酸血症小鼠尿酸排泄效果最好。但给药别嘌呤醇和知黄痛风汤对血清肌酐含量无明显影响。与正常组比较,模型组小鼠肾脏URAT1和GLUT9蛋白表达水平明显升高(P<0.01),OAT1、OCT1、OCT2蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。知黄痛风汤组与模型组比较,高尿酸血症小鼠肾脏URAT1和GLUT9的蛋白表达水平明显降低(P<0.05),OAT1、OCT1、OCT2的表达量明显升高(P<0.05)。对小鼠肾脏进行高通量测序,共有19个mi RNA在正常组、模型组、高剂量组之间具有明显的药效学差异。(三)对大鼠右踝关节滑膜组织中的炎症因子进行检测,与正常组相比,模型组大鼠滑膜中白细胞介素-1β(1L-1β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)显著升高(P<0.01),给药知黄痛风汤高、中、低剂量的大鼠与模型组相比,1L-1β及TNF-α显著降低(P<0.01或P<0.05)。对大鼠滑膜组织进行基因芯片分析,得到Arrb2、Caspase-1、Flna、Cxcl9、Ptpn6、Myh11、RT1-CE16、Cyp2j10、,Pla2g7、Pla2g2d等基因的m RNA具有明显关联性,其中Arrb2、Caspase-1与多个m RNA存在明显的关联,处于网络的中心位置。且Arrb2蛋白的表达在模型组大鼠较正常组明显减少,知黄痛风汤组大鼠较模型组明显增加(P<0.05)。炎性体NLRP3是一种大分子复合体,它主要由NLRP3蛋白、caspase-1、凋亡相关点样蛋白(ASC)组成,尿酸钠晶体能激活NLRP3基因协同ASC蛋白相互作用驱动caspase-1的释放,其中caspase-1主要参与炎症反应,在NLRP3炎性体促炎作用中发挥核心作用。所以我们考察了NLRP3的表达量,模型组中NLRP3的表达量较正常组显著升高(P<0.05),灌胃知黄痛风汤后,NLRP3的表达量较模型组明显降低(P<0.05)。(四)急性毒性实验证明知黄痛风汤并未对小鼠产生任何不良反应,进食状态、精神状态均良好,体重也呈正常增长趋势,血液指标显示肝肾功能未受明显损伤,对小鼠的病理切片进行分析,也进一步证明了小鼠的脏器并未发生病变。结论:本论文将知黄痛风汤从质量标准、药效学作用机制与毒理学研究等几个方面进行研究,结果表明:知黄痛风汤在制备过程中稳定可靠,为后期的药效学及作用机制研究打下了基础;知黄痛风汤可以通过明显增加URAT1、GLUT9的活性,降低OAT1、OCT1、OCT2活性,起到降低高尿酸血症小鼠血尿酸、血尿素氮含量,增加尿酸排泄,保护肾功能的目的;知黄痛风汤通过降低大鼠体内的炎症因子IL-1β、TNF-α水平来使其步态恢复正常和消除肿胀;知黄痛风汤通过增加Arrb2表达,抑制炎性小体NLRP3的表达,从而抑制炎症因子IL-1β、IL-18的表达,减轻痛风性关节炎的症状;知黄痛风汤无明显急性毒性反应,安全性高。