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硬蜱是一种依靠吸食宿主血液生存的节肢动物，是多种疾病的贮藏宿主和传播媒介。新疆硬蜱种类繁多，约45种。新疆马匹存栏量位于我国首位，相关产业较发达，而草食家畜混合放牧的方式使硬蜱与马匹接触更频繁、更容易，也增加了马匹患驽巴贝斯虫病的几率，继而制约了新疆畜牧业经济发展。驽巴贝斯虫病是经媒介蜱传播的原虫病之一，呈全球性流行，急性病例可导致患马死亡，而慢性和亚急性病马可终身带虫。目前，该病的防治尚无理想的驱虫药物和疫苗，并且存在对我区硬蜱的种类和生物学特性不明确，缺乏对传播驽巴贝斯虫病监控以及相关疫苗候选抗原蛋白的研究数据等问题。为解决上述问题，本研究通过形态学、分子生物学和统计学的方法，对在南北疆5个试验点所采集的蜱虫及马血样品进行种属和驽巴贝斯虫病原检测分析。同时，克隆表达驽巴贝斯虫HSP70基因，研究其对外周血单核细胞(PBMC)的影响，为进一步开发相关疫苗以及驽巴贝斯虫入侵机制研究提供数据支撑，也为我区蜱虫及马驽巴贝斯虫病的综合防控奠定基础。
(Ⅰ)本试验采集了5个试验点504份马血液样本和620枚硬蜱，采用形态学和分子生物学鉴定其种属，对优势种-边缘革蜱经“供兔饲蜱”试验观察生活周期。用解剖镜和ESEM对其各龄期形态、超微结构进行观察。经PCR方法扩增边缘革蜱及马血液样品中驽巴贝斯虫Bc48基因目的片段。结果显示，在620枚硬蜱中，599枚确定为边缘革蜱；在实验室条件下(温度：25±1℃，湿度：75±5%)边缘革蜱的生活史约为93d。经观察发现，边缘革蜱各龄期超微结构上存在区别，即：幼蜱仅有3对肢节，没有生殖孔和气门板，齿式呈2|2；若蜱无生殖孔，肛门瓣上有3对刚毛，4对肢节，基突开始出现，齿式呈3-2|2-3；雄性成蜱有气门板和生殖孔，肛门瓣上有5对半刚毛，第Ⅳ肢节腹面有3个齿状突，齿式呈3|3；雌性成蜱的假头基背面具有一个细而浅的横缝，孔区的每一侧都有1根刚毛，肛门瓣上有5对刚毛，第Ⅳ肢节腹面有3个较小的齿状突，口下板齿冠有小齿，齿式呈4-3|3-4。在血源性和蜱源性样品中，均扩增出了451bp的Bc48基因目的片段，与测序结果相一致；统计分析结果显示，在504份马血样品中，总阳性率是10.71%，北疆试验点阳性率高于南疆，大于3岁的马匹易感，不同试验点之间存在显著差异，各年龄段之间无差异。在599枚边缘革蜱中，该病原的携带率为36.91%。其中，饱血雌蜱的携带率最高，为79.17%。雌蜱的总携带率为43.62%高于雄蜱，两者存在极显著差异性。此外，在虫卵中也检测到了该病原，这是首次在中国发现边缘革蜱及其虫卵携带驽巴贝斯虫。这为边缘革蜱各龄期形态和“经卵传播”等生物学特性研究以及驽巴贝斯虫病综合防治提供数据参考。
(Ⅱ)基于马驽巴斯虫功能基因及候选抗原的筛选，用PCR方法扩增新疆地方驽巴贝斯虫株截短HSP70基因片段，构建HSP70-pET32a重组质粒，测序鉴定并利用NCBI、ProtParam等软件分析目的序列，获得生物信息学数据。经过IPTG诱导后，用SDS-PAGE和WesternBlot鉴定。结果显示，该试验获得429bp目的片段，编码143个氨基酸，与GenBank中相应巴贝斯属比对，种内遗传距离为0；生物信息学数据表明，该重组蛋白是一种亲水性分泌性蛋白，稳定性较好，具有7个抗原表位。经验证，该重组蛋白大小为33kDa，是包涵体蛋白；纯化后，纯度是1.8，浓度为0.63mg/mL，具有较好的免疫原性，多克隆抗体效价可达1:1024000。
(Ⅲ)以驽巴贝斯虫入侵机制为着眼点，体外分离健康马PBMC，用CCK8试剂盒、IFA和流式细胞术检测分析重组HSP70蛋白对PBMC结合、增殖、吞噬和凋亡的影响。将10μg/mLHSP70重组蛋白与PBMC共孵育，DAPI着染细胞核，用GoatAnti-HorseIgGH&L(FITC)标记重组蛋白。经过荧光倒置显微镜观察，与对照组相比，发现试验组不仅有被DAPI着染细胞核发出蓝色荧光，仅在调节激发光后，发现相同位置出现用GoatAnti-HorseIgGH&L(FITC)标记重组蛋白发出绿色荧光，表明该重组蛋白可以与PBMC结合；用10μg/mL，20μg/mL和40μg/mLHSP70重组蛋白刺激PBMC，40μg/mLHSP70重组蛋白可显著促进PBMC增殖，10μg/mL和20μg/mL的促进作用不显著；用流式细胞术检测，发现10μg/mLHSP70重组蛋白可极显著的促进PBMC的吞噬作用，20μg/mL和40μg/mL的促进作用不显著；经FITCAnnexinV和PI染色后，用流式细胞术检测发现，不同浓度的HSP70重组蛋白对PBMC凋亡作用不同，对早凋和晚凋都有影响，其中，在PBMC早期凋亡中影响更明显。
(Ⅰ)本试验采集了5个试验点504份马血液样本和620枚硬蜱，采用形态学和分子生物学鉴定其种属，对优势种-边缘革蜱经“供兔饲蜱”试验观察生活周期。用解剖镜和ESEM对其各龄期形态、超微结构进行观察。经PCR方法扩增边缘革蜱及马血液样品中驽巴贝斯虫Bc48基因目的片段。结果显示，在620枚硬蜱中，599枚确定为边缘革蜱；在实验室条件下(温度：25±1℃，湿度：75±5%)边缘革蜱的生活史约为93d。经观察发现，边缘革蜱各龄期超微结构上存在区别，即：幼蜱仅有3对肢节，没有生殖孔和气门板，齿式呈2|2；若蜱无生殖孔，肛门瓣上有3对刚毛，4对肢节，基突开始出现，齿式呈3-2|2-3；雄性成蜱有气门板和生殖孔，肛门瓣上有5对半刚毛，第Ⅳ肢节腹面有3个齿状突，齿式呈3|3；雌性成蜱的假头基背面具有一个细而浅的横缝，孔区的每一侧都有1根刚毛，肛门瓣上有5对刚毛，第Ⅳ肢节腹面有3个较小的齿状突，口下板齿冠有小齿，齿式呈4-3|3-4。在血源性和蜱源性样品中，均扩增出了451bp的Bc48基因目的片段，与测序结果相一致；统计分析结果显示，在504份马血样品中，总阳性率是10.71%，北疆试验点阳性率高于南疆，大于3岁的马匹易感，不同试验点之间存在显著差异，各年龄段之间无差异。在599枚边缘革蜱中，该病原的携带率为36.91%。其中，饱血雌蜱的携带率最高，为79.17%。雌蜱的总携带率为43.62%高于雄蜱，两者存在极显著差异性。此外，在虫卵中也检测到了该病原，这是首次在中国发现边缘革蜱及其虫卵携带驽巴贝斯虫。这为边缘革蜱各龄期形态和“经卵传播”等生物学特性研究以及驽巴贝斯虫病综合防治提供数据参考。
(Ⅱ)基于马驽巴斯虫功能基因及候选抗原的筛选，用PCR方法扩增新疆地方驽巴贝斯虫株截短HSP70基因片段，构建HSP70-pET32a重组质粒，测序鉴定并利用NCBI、ProtParam等软件分析目的序列，获得生物信息学数据。经过IPTG诱导后，用SDS-PAGE和WesternBlot鉴定。结果显示，该试验获得429bp目的片段，编码143个氨基酸，与GenBank中相应巴贝斯属比对，种内遗传距离为0；生物信息学数据表明，该重组蛋白是一种亲水性分泌性蛋白，稳定性较好，具有7个抗原表位。经验证，该重组蛋白大小为33kDa，是包涵体蛋白；纯化后，纯度是1.8，浓度为0.63mg/mL，具有较好的免疫原性，多克隆抗体效价可达1:1024000。
(Ⅲ)以驽巴贝斯虫入侵机制为着眼点，体外分离健康马PBMC，用CCK8试剂盒、IFA和流式细胞术检测分析重组HSP70蛋白对PBMC结合、增殖、吞噬和凋亡的影响。将10μg/mLHSP70重组蛋白与PBMC共孵育，DAPI着染细胞核，用GoatAnti-HorseIgGH&L(FITC)标记重组蛋白。经过荧光倒置显微镜观察，与对照组相比，发现试验组不仅有被DAPI着染细胞核发出蓝色荧光，仅在调节激发光后，发现相同位置出现用GoatAnti-HorseIgGH&L(FITC)标记重组蛋白发出绿色荧光，表明该重组蛋白可以与PBMC结合；用10μg/mL，20μg/mL和40μg/mLHSP70重组蛋白刺激PBMC，40μg/mLHSP70重组蛋白可显著促进PBMC增殖，10μg/mL和20μg/mL的促进作用不显著；用流式细胞术检测，发现10μg/mLHSP70重组蛋白可极显著的促进PBMC的吞噬作用，20μg/mL和40μg/mL的促进作用不显著；经FITCAnnexinV和PI染色后，用流式细胞术检测发现，不同浓度的HSP70重组蛋白对PBMC凋亡作用不同，对早凋和晚凋都有影响，其中，在PBMC早期凋亡中影响更明显。