诺丽(Morinda citrifolia Linn.)属于茜草科巴戟天属,作为传统的药用植物,诺丽的根、皮、果和叶对多种疾病的治疗有显著效果,其还有抗菌、抗炎、增敏、镇痛和增强免疫等功能。诺丽果的提取物对多种病原真菌和病原细菌具有抑制作用,所以研究其内生真菌的抑菌性也极具意义。将本实验室前期分离得到的50株诺丽内生真菌用传统方法进行简单鉴定。并对其进行抑菌性测试,用平板对峙法对3株病原真菌进行抑菌测试,滤纸片扩散法对4株病原细菌进行抑菌测试。采用传统方法和分子生物学相结合来鉴定抑菌性较强的内生真菌M2的种属关系。通过单因素试验和正交设计对内生真菌M2进行发酵优化,筛选出最合适的发酵条件。以优化好的条件发酵内生真菌M2,将其次生代谢产物进行水域加热和紫外灯照射测试其稳定性。得到的结论如下:(1)通过观察各菌株的分生孢子等显微结构,初步完成36个菌株的鉴定。36个菌株分属于9目1 1科1 1属,其中1 7株菌株为曲霉属,其为诺丽内生真菌种群绝对的优势菌种。(2)用五点对峙法进行初步筛选发现19株菌株至少对稻瘟病菌、西瓜枯萎病菌与辣椒疫霉的2种具有抑制作用。根据上述结果用两点对峙法对上述菌株进行复筛,结果发现,除了菌株M49对稻瘟病菌没有抑制效果外,其他菌株对病原真菌都有一定程度的抑制。其中,菌株J7和M35对3种病原真菌都有强烈的抑制。曲霉属的内生真菌具有抑菌性的有6株,占具有抑菌性菌株的31.58%。用滤纸片扩散法发现18株菌株至少对1株病原细菌具有抑制,占测试菌株的35.29%;9株对2种病原细菌有抑制,占测试菌株的17.65%;菌株M2,M33,M50,M53对4种病原细菌都有抑制,其抑菌性具有广谱性。。曲霉属内生真菌有8株具有抑菌性,占具有抑菌性菌株的44.44%。(3)内生真菌M2在培养基表面凸起,背面有褶皱,菌丝为白色,孢子为褐色。其菌丝为有隔菌丝,在菌丝顶端有特化厚壁的足细胞和分生孢子梗,上端形成膨大的孕性顶囊,顶囊表面有分生孢子,分生孢子串生于小梗顶端呈柱形。将内生真菌M2的ITS区域序列测序,将得到的扩增片段590 bp序列在NCBI数据库中进行B1ast比对。初步将其鉴定为棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus),在NCBI数据库中登录号为MK560191。(4)通过单因素试验,用滤纸片法测试其对4种指示细菌的抑制作为参考,结果筛选出葡萄糖、硝酸钠、磷酸二氢钾和七水合硫酸镁作为营养元素,用正交设计筛选出葡萄糖、硝酸钠、磷酸二氢钾和七水合硫酸镁最佳的浓度配比。在通过单因素试验筛选出最适合发酵的非营养元素条件装液量、温度、pH值和转速。内生真菌M2优化后的培养基方案:200 g上豆煮沸30 min浸出液、葡萄糖20 g、硝酸钠5 g、磷酸二氢钾0.2 g、七水合硫酸镁0.2 g、1000 mL双蒸水;发酵条件,150 mL锥形瓶装液50 mL、温度25℃、培养基初始pH值为8、转速1 70 r·min-1。(5)高温对内生真菌M2的抑菌性影响不大,内生真菌代谢产物热稳定性较好。当温度高于80℃时,内生真菌M2对4种指示细菌的抑制效果相较于对照有显著的下降。温度为121℃时,其抑菌性下降25%左右。内生真菌M2代谢产物经过相同波长紫外线照射之后,随着照射时间的增加,抑菌性有一定下降。在经过紫外线10h的照射,内生真菌对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制分别下降了 1 2.24%、16.27%、21.67%和 20.75%。综上所述,诺丽含有丰富的内生真菌,曲霉属内生真菌为优势种群。且部分内生真菌抑菌活性强,内生真菌M2经过发酵优化其抑菌性显著增加,可以为以后研究其代谢产物提供理论依据。