论文部分内容阅读
本研究通过对木本基质下培养的糙皮侧耳7株不同菌株进行降解木质素的高效菌株进行筛选,对筛选出来的糙皮侧耳菌株采用Illumina HiSeq 4000 SBS高通量测序平台进行转录组测序,挖掘糙皮侧耳降解木质基质的候选基因,通过比对到NR、Swissprot、KEGG、String、Pfam等数据库中得到差异基因相关信息,再通过GO富集分析、pathway富集分析,得到与降解木质素、纤维素相关的候选基因以及相关的主要代谢通路。再对与木质素降解相关的候选基因中挑选出3个过氧化物酶基因c30793-g1、c28624_g1、c31898_g1,利用基因工程手段对3个过氧化物酶基因进行克隆以及异源表达载体的构建,主要研究结果如下:1、对糙皮侧耳四季大白、平菇1号、平菇2号、pL109、pL206、pL305、pL539这7株菌株进行了定性筛选和定量筛选,通过变色圈实验来实现对菌株的定性,实验结果表明7株菌株均有降解木质素的能力,根据菌落直径与变色圈直径比值d1/d2以及生长状况筛选出四季大白与PL305降解木质素的能力较强。定量筛选通过计算木质素降解率和综纤维素降解率以及SF值,SF值0.91为平菇1号和PL206,SF值0.83为四季大白。木质素降解率最高的为四季大白14.87%,,综纤维素降解率最低为PL109为7.80%。综上筛选出四季大白是本次实验的高效菌株。2、转录组测序共得到有效数据共78.47Gb,糙皮侧耳转录本序列64228条,单基因序列共46417条。使用BLast工具将转录本序列比对到NR、Swissprot、KEGG、String、Pfam等数据库中,共有33736条序列得到注释。得到1408条差异表达基因,其中有1183条基因为上调,通过GO富集分析得到,差异基因显著富集于木质素分解代谢过程、锰过氧化物酶活性、苯丙素分解代谢过程中。将差异基因比对到KEGG数据库中,共有313条得到注释的序列并对其进行pathway富集分析,得到差异基因显著富集于氨基苯甲酸降解过程、色氨酸代谢、β-丙氨酸代谢、等通路中。其中c27028_g1、c28624_g1、c30793_g1、c30849_g1等基因与木质素降解过程相关性较高。c24893_g1、c29559_g1、c29956_g2等基因与纤维素降解的过程相关性较高。转录组数据分析结果筛选出来的与木质素降解相关的候选关键基因中,挑选出c31898_g1、c28624_g1、c30793-g1三个过氧化物酶基因,利用RT-PCR技术对这3个基因进行了克隆,成功克隆3个基因后,进行PMD-19T载体的连接,得到了c30793-PlxMD19-T、c28624-PMD19-T、c31898-PMD19-T 三个重组载体,c30793-PMD19-T、c28624-PMD19-T、c31898-PMD19-T三个重组载体与目的载体pGAPZαA进行双酶切,酶切后进行连接,成功构建3个重组表达载体c28624-pGAPZαA、c31898-pGAPZαA、c30793-pGAPZαA。