背景与目的:原发性肝癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一,在各种肿瘤致死原因中,因肝癌所导致的死亡在男性中列第2位,在女性中列第6位,严重危害人们的健康,其中,肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是最主要的病理组织学类型,约占85%。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）及或者丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）感染是导致HCC最主要的感染性因素。男性高发是HCC一个重要的流行病学特点,性别差异与HCC的发生一直受到国内外学者的关注。近期,对华东、华南、华北和华西多个医疗中心统计总计13003例HCC的分析发现,我国84.4%的HCC与HBV感染相关,HBV感染所致HCC 比 HCV所致HCC早发病12年,HBV相关性HCC的男性与女性病例数的比值为6.6:1,高于HCV所致HCC的男女之比,后者为4.0:1。上世纪八十年代,在我国台湾地区未进行抗病毒治疗的慢性乙肝队列的研究发现,性别差异也体现在HBV感染者的疾病进展过程中,无症状携带期男女的病例数比值为1.2:1,慢性乙肝期男女比值为6.3:1,肝癌期男女比值高达9.8:1。对于HBV导致HCC男性高发的机制,已有研究主要关注性激素对HBV转录复制的影响,研究指出雄激素受体可促进HBV转录复制,雌激素受体抑制HBV转录,由此增加或降低HCC风险。然而,在台湾地区未进行抗病毒治疗的慢性乙肝队列研究中发现,以血清e抗原反映HBV复制指标,与同龄女性感染者的e抗原阳性者相比,30岁以上男性HBV感染者的e抗原清除更快,采用雄激素受体与HBV本身相互作用难以全面解释男性HCC高发。慢性HBV感染者进展为HCC受多种因素的影响,除性别因素外,感染者接触化学致癌物,如黄曲霉毒素（aflatoxin B1,AFB1）,显著增加HBV进展为HCC的发病风险。我国大多数HCC与HBV感染有关,基于人群的肿瘤登记数据表明,全国范围内的男女肝癌发病人数比值为2.80:1,然而,启东地区人群在1972～2011年间的肝癌男女发病人数比值为3.14:1。启东是一个确定的AFB1高暴露地区,该地区的肝癌发病率及男女发病比值均高于全国其他地区,由此提示:除HBV感染外,性别与性激素在基因毒性物质致HCC过程中也发挥重要作用。已有研究表明,AFB1通过芳香烃受体（Aryl Hydrocarbon Receptor,AHR）被转运至细胞内,在细胞色素P450（CYP450）氧化酶家族成员的作用下发生生物转化,部分经羟基化形成代谢产物黄曲霉毒素M1（Aflatoxin M1,AFM1）从尿液排泄,部分形成黄曲霉毒素-8,9-环氧化物（AFBO）,后者与宿主基因组DNA结合形成AFB1-N7-鸟嘌呤（AFB1-DNA）加合物,从而产生基因毒性。目前的研究表明,性激素和性染色体在控制癌症起始细胞群、代谢、肿瘤微环境形成、及免疫反应等多方面均发挥重要作用,由此影响肿瘤的发生发展及对相关治疗的敏感性,包括基因毒性剂的化疗和免疫治疗。但十年前已开展的抗雄激素或抗雌激素在晚期肝癌治疗的临床试验中,均未达到预期效果。因此,有必要从HCC的基因与转录水平上,深入分析发现性别差异的特征,并解析性别及雄激素在HBV相关HCC中可能的作用与机制。本论文的研究目的:（1）寻找HBV相关性HCC基因组特征的性别差异;（2）寻找HBV相关性HCC表达特征的性别差异,特别是HBV与基因毒性物联合作用下诱导的HCC生物学行为的性别特征,重点关注肿瘤免疫学特征的性别差异,探讨雄激素作用的可能机制;（3）基于性别差异的特征的基础,寻找改善抗PD-1免疫治疗效果的策略。我们从江苏省启东肝癌防治研究所收集获得了 126例（男性72例,女性54例）经病理学诊断明确为HCC患者的癌组织及对应的癌旁组织,全部患者均为当地居民,样本均保存在-80℃,患者血清中均存在HBV的病毒学感染指标,在HCC诊断的5-17年之前,其尿液中均检测到AFM1,这些样本为HBV感染后暴露于AFB1所致HCC,在本研究中称之为QD-HCC。我们对101例样本进行了基因组测序,87例样本进行了转录组测序,其中的62例样本（男性18例,女性44例）同时进行了基因组与转录组测序。为进一步明确基因毒性致癌物如AFB1的作用,我们从TCGA数据库中获取了 119例HBV相关性HCC样本的基因组与转录组测序数据,排除6例有AFB1暴露突变特征的病例,筛选出113例（73例男性和40例女性）HBV相关性HCC进行分析,在本研究中称之为TCGA-HCC。由于组织细胞表型的性别差异是组织细胞的特异性转录因子与性激素共同作用调控的综合结局。我们采用了来源于肝上皮、HBV 阳性的肿瘤细胞系HepG2.2.15和PLC/PRF/5,分析探讨了AFB1与雄激素联合作用对性别差异相关基因表达的影响,进而利用同类系小鼠模型探讨了增强雄激素信号在HCC抗肿瘤免疫中的作用及可能的机制。方法与结果:1.体细胞基因突变的性别差异我们对101例QD-HCC样本（男性47例,女性54例）进行了全基因组或外显子测序,使用GATK流程进行生物信息学分析获取体细胞突变信息。结果显示在全基因组及外显子水平上,男性与女性QD-HCC样本的单碱基替换（single base substitutions,SBSs）数量无差异,肿瘤突变负荷（tumor mutational burden,TMB）及突变模式无差异。对TCGA-HCC的基因组测序数据采用同样的分析,结果显示男性与女性TCGA-HCC样本的SBS数量、TMB及突变模式也无差异。采用卡方检验或Fisher精确检验比较了 QD-HCC样本中的男性与女性的所有可编码蛋白的基因的突变频率。在已报道确定的75个HCC驱动基因的突变频率中未发现性别差异,但检测到另外71个基因的突变频率存在着性别差异,其中有些基因突变是其他肿瘤如肺癌、黑色素瘤的驱动突变。在这71个基因中,62个基因在男性中高突变,其中PAK7,ANP32E,CEP250,ATXN2与男性HCC患者的不良预后显著相关,而在女性HCC患者中未检测到。9个基因在女性中高突变,其中GTF21存在高频SNP突变位点（chr7:74159247）,该位点较易发生单碱基G＞A的替换。进一步根据临床信息对样本进行分析发现,具有肝硬化背景的HCC患者,或在非肝硬化背景的患者,或血清中AFP＜20 ng/mL的患者,肿瘤中的基因突变频率均存在性别差异。对TCGA-HCC中的样本数据采用同样的方式分析,发现7个基因的突变频率存在性别差异,其中4个基因在男性中高突变,包括已报道的HCC驱动基因TP53,在男性中的突变频率为30%,而女性中仅为10%。由此表明,在体细胞突变水平上,HCC基因组存在性别差异。2.HBV整合的性别差异对全基因组测序的88例QD-HCC样本（男性36例,女性52例）进行HBV整合分析。在37例癌组织中检测到110个HBV整合断点,HBV整合频率及断点数量无性别差异。然而,具有结合AR及HNF4α能力的HBV断点仅在男性HCC组织中被检测到。在HBV基因组水平上,男性QD-HCC样本中检测到HBV的S基因区断点占比更多,而在女性QD-HCC样本中检测到位于X基因区断点的占比更多。在宿主基因组水平上,HBV断点主要在5号染色体上被检测到,无性别差异。而HBV在19号染色体上的断点数量,男性多于女性,3号染色体上的断点数量,女性多于男性。QD-HCC样本中的HBV整合影响的靶基因（HBV-integration targeted genes,ITGs）及其功能也存在着性别差异。因此,结合体细胞突变的分析结果,进一步说明HCC基因组存在性别差异。3.基因表达及功能通路的性别差异对87例QD-HCC样本（男性43例,女性44例）的癌组织及其对应的癌旁组织进行了转录组测序。采用Hisat2,StringTie和Ballgown分析流程,使用limma包进行差异基因分析,发现男性与女性QD-HCC中存在3070个显著差异表达的基因（differentially expressed genes,DEGs）,其中 2352 个 DEG 在男性 QD-HCC 中高表达。相对于女性QD-HCC,男性QD-HCC样本高表达AR。对所有可编码蛋白的基因进行了 GSEA（gene set enrichment analysis）及 GSVA（gene set variation analysis）富集分析,结果显示,肿瘤细胞本身的生物学特征存在性别差异,男性QD-HCC样本中的Wnt/β-catenin信号及Notch信号通路基因表达增强,非特异性的炎症反应通路被激活,但双链DNA断裂（double strand break,DSB）修复途径与特异性抗肿瘤免疫应答相关通路被抑制。为进一步验证,对TCGA-HCC的转录组测序数据采用同样的方式分析,结果显示相对于女性TCGA-HCC,男性TCGA-HCC高表达AR及ESR1,GSVA富集分析显示大多数存在性别差异的通路与QD-HCC样本的结果一致。由此表明,不同性别的患者可能采用不同的转录调控机制,而影响HCC的发生与其生物学行为。4.AFB1代谢通路的性别差异由于QD-HCC患者的样本是慢性HBV感染与AFB1高暴露共同作用的结局,我们比较了其AFB1代谢相关基因表达的性别差异,发现相对于女性QD-HCC,男性QD-HCC样本中的AHR与CYP1A1基因显著高表达,利用免疫组化染色证实了AHR和CYP1A1蛋白表达的增强。同样在TCGA-HCC中,我们也发现男性TCGA-HCC样本中的AHR基因及CYP450家族中与AFB1代谢相关基因显著高表达,包括CYP1A1,CYP1A2,CYP3A4。为探讨雄激素对AHR和CYP1A1表达的影响,以及对AFB1基因毒性的影响,我们采用HBV阳性的HCC细胞系HepG2.2.15和PLC/PRF/5进行分析,与采用相同浓度AFB1单独处理组相比,在采用AFB1与雄激素联合处理后,这些细胞的AHR及CYP1A1的表达显著增加,雄激素加入后,使AFB1导致HepG2.2.15和PLC/PRF/5细胞死亡的浓度降低了约50%,并形成更多的AFB1-DNA加合物。5.DNA损伤应答通路的性别差异AFB1-DNA加合物的形成导致了 DNA损伤。GSVA富集分析结果显示相对于女性QD-HCC,男性QD-HCC样本的DSB修复通路显著被抑制。进一步分析了其DNA损伤应答相关基因的性别差异,发现男性QD-HCC样本的非同源末端连接（nonhomologous end joining,NHEJ）相关基因的表达水平显著低于女性QD-HCC样本,如ATM,XRCC5,NBN,MRE11,XRCC4。同样在TCGA-HCC中分析发现,男性样本中的NHEJ相关基因,如ATM,MRE11,LIG4的表达水平显著低于女性样本。同样采用了 HepG2.2.15和PLC/PRF/5分析雄激素对NHEJ相关基因表达的影响。与AFB1单独处理组相比,在AFB1与雄激素联合处理后,两株细胞系中的XRCC4,LIG4或MRE11的表达水平显著降低。值得注意的是,当加入17β-雌二醇后,XRCC4及MRE11的表达增加。通过MEME在线工具的分析,在AHR、CYP1A1、XRCC4、LIG4或MRE11基因的启动子区域均存在雄激素应答元件。结合AFB1代谢通路的分析结果表明,HCC生物学行为的改变,可能受性激素的影响。6.肿瘤组织的cGAS-STING通路的性别差异慢性基因毒性可导致细胞核内的双链DNA（double-strand DNA,dsDNA）断裂而泄露至细胞质中,从而被胞浆中的cGAS所识别,激活STING依赖性细胞因子的产生。对QD-HCC样本的分析发现,相对于女性样本,男性样本中的IFN-I信号和应答相关基因,及STING和IRF3的表达水平显著上调。为验证这一观察,采用HepG2.2.15和PLC/PRF/5细胞系进行分析,结果显示,与采用同样浓度的AFB1单独处理组相比,在AFB1与雄激素联合处理后,两株细胞系中的γH2AX蛋白表达均显著增强,有更多的dsDNA从细胞核渗漏到细胞质中,免疫印记显示cGAS、磷酸化STING和磷酸化IRF3的蛋白水平显著增强,HepG2.2.15细胞中IFNB1的表达水平显著升高,PLC/PRF/5细胞中IFNB1的表达水平改变无统计学差异。由此表明,雄激素可抑制HCC的DSB修复,从而导致细胞核dsDNA渗漏到细胞质而促进cGAS-STING通路活化。7.抗肿瘤免疫应答的性别差异基于上述结果,我们分析了不同性别HCC的抗肿瘤免疫特征。结果发现在QD-HCC中,男性样本的肿瘤组织中的浸润CD8+T细胞数量明显高于女性样本。与对应的癌旁组织相比,男性癌组织中高表达PD-1,CTLA-4,B7-H2,B7-H3,低表达CD80（B7.1）和CD86（B7.2）。免疫组化染色证实了 PD-1和B7-H2在男性样本的肿瘤组织中表达增强,而在女性样本中,这些基因的表达在癌与癌旁组织中无差异。为验证这一观察是否受雄激素的影响,我们采用HepG2.2.15和PLC/PRF/5进行分析,结果显示,与AFBi单独处理相比,在AFB1与雄激素共同作用下,两株肿瘤细胞系表面B7-H2和B7-H3表达明显升高。收集这些处理的HCC细胞上清,通过T细胞趋化实验模拟免疫细胞向肿瘤组织中的浸润。结果显示,经AFB1与雄激素联合处理的HCC细胞的培养上清,可促进更多活化的CD8+PD-1+T细胞的迁移。由此表明HCC细胞在AFB1与雄激素共同作用下,增强了 HCC细胞的免疫检查点分子的表达,同时,这些细胞所产生的可溶性因子可募集更多的CD8+T细胞向肿瘤组织的浸润。所以,虽然男性QD-HCC样本的肿瘤组织中存在更多CD8+T细胞,但由于免疫检查点分子的高表达,而表现出抑制性的抗肿瘤免疫微环境。8.增强AR信号通路可促进肿瘤的CD8+T细胞浸润,从而增强抗PD-1的免疫治疗效果进而,我们采用两株小鼠肝癌细胞系Hepa1-6和H22,在两个性别的同类系小鼠模型中采用他莫昔芬灌胃抑制ER信号以活化AR信号通路,分析雄激素信号活化增强免疫检查点分子（PD-1）抑制剂的抗肿瘤作用。在未给予他莫昔芬也未注射PD-1抗体的小鼠中,与雌性小鼠相比,雄性小鼠肿瘤组织中即存在更多CD8+T细胞浸润。与采用单纯抗PD-1抗体治疗的小鼠相比,在两个性别的两株小鼠肝癌细胞模型中均观察到,联合他莫昔芬与抗PD-1治疗后,肿瘤更快消退,然而采用氟他胺抑制AR信号后雄鼠的肿瘤增大。收集肿瘤组织分析发现,联合他莫昔芬与抗PD-1治疗后,有更多CD8+T细胞浸润到肿瘤组织,肿瘤组织中的NHEJ相关基因表达降低,而cGAS-STING通路相关基因表达升高;然而,氟他胺处理的雄鼠肿瘤中NHEJ相关基因的表达升高,cGAS-STING通路相关基因被抑制,CD8+T细胞浸润降低。由此说明HCC组织中的AR信号通路的活化,抑制了 NHEJ相关基因的表达,由此激活肿瘤组织的cGAS-STING通路,促进了肿瘤的CD8+T细胞浸润,从而增强抗PD-1的免疫治疗效果。结论:在HBV相关性HCC中,男性与女性的体细胞突变存在不同,肿瘤细胞本身的生物学特征存在差异。暴露于基因毒性物质如AFB1后,雄激素信号促进了 AFB1代谢相关基因和免疫检查点分子的高表达,抑制了 NHEJ相关基因对DSB损伤的修复,推测可能促进了慢性HBV感染的男性更容易发展为AFB1相关性HCC;另外,雄激素信号通过抑制DSB损伤的修复,导致了更多的dsDNA泄露至细胞质中,从而激活了 cGAS-STING通路,促进了 CD8+T细胞浸润到肿瘤组织中,从而可能改善HCC的抗PD-1免疫治疗的效果。雄激素在HBV感染者向HCC发生发展的不同阶段可能发挥不同的作用。