斑马鱼D3b基因结构及其在胚胎发育中的作用研究

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甲状腺激素在调控细胞的生长代谢中发挥重要作用。在成年人中,甲状腺激素调节一生的能量代谢水平。在胚胎、新生儿、儿童期,甲状腺激素介导细胞增殖和分化。甲状腺激素是通过T3与甲状腺激素受体的结合起作用的,但正常情况下,甲状腺分泌的主要是T4。T4在外环脱碘,而转化为T3,这将使其生物活性明显增强;而T4和T3若在内环脱碘,将使它们分别生成为反T3(rT3)和T2,从而丧失其生物学活性。参与这一过程的主要是甲状腺激素脱碘酶。在人和哺乳动物中主要存在3种不同类型的甲状腺激素脱碘酶,分别有3种不同的基因编码(Deiodinase,简称dio)。其中有dio1和dio2编码的甲状腺激素脱碘酶1和2(简称D1,D2)是主要催化甲状腺激素的外环脱碘,可使T4转变为T3,从而增加甲状腺激素的生物学活性。但有dio3编码的甲状腺激素脱碘酶3(简称D3),主要发挥甲状腺激素的内环脱碘酶的功能,可以将T4和T3分别转化为rT3和T2,从而是甲状腺激素的活性丧失,它也是体内唯一的催化甲状腺激素失活的酶。  斑马鱼中由于基因复制存在两个dio3基因,一个是dio3a,一个是dio3b。我们研究的主要目的是鉴定是否两个dio3基因都有功能以及它们在胚胎发育中的作用是否相同。研究发现这两个基因与人dio3都是同源基因。体外研究证实同源基因dio3a,dio3b都可以编码有活性的蛋白,都可以使T4和T3失活。虽然斑马鱼D3a和D3b酶的动力学性质非常相似,但它们的基因结构与表达模式非常不同。我们第一次鉴定了dio3b的基因结构不同于以往发现的任何dio3基因,含有一个巨大的内含子将其开放阅读框和硒氨酸插入序列(SECIS)分开。SECIS通常位于3UTR上,是酶的催化活性和硒蛋白的合成所必须的,介导硒氨酸识别UGA密码子。最大敏感性检测发现斑马鱼D3a可以外环脱碘rT3,这与其他D3蛋白都不同。这些数据提示D3a和D3b在发育中的作用可能不同。  进一步研究发现,斑马鱼的D1不能催化T4到T3的转变,也不具有T3的内环脱碘作用.这说明在斑马鱼体内D2是主要的催化甲状腺激素激活的酶,D3是T4和T3主要的失活酶。  D3在人的胎盘和胎儿期表达最高,我们猜测其在胚胎发育中具有重要作用。利用morpholino介导的基因敲除我们发现dio3b敲除后斑马鱼胚胎发育明显迟缓,72小时身体明显变短。dio3a敲除后胚胎没有明显异常。dio3b敲除导致的身体变短的表型可以被甲状腺激素拮抗剂部分逆转,说明dio3b敲除身体变短的这一表型是通过甲状腺激素的信号途径介导的特异表型,并且是由局部组织的甲状腺激素信号通路的升高引起的。给予外源性T3刺激时斑马鱼胚胎长度没有明显异常,但其体内dio3b和dio3a的表达量和酶活都显著升高。  甲状腺激素诱导的凋亡在两栖动物变态发育过程中非常重要。我们发现dio3b敲除后甲状腺激素诱导凋亡的关键基因Bax和Bcl-XL有明显上调,同时还发现tp53基因表达显著升高。我们推测dio3b敲除身体变短这一表型与P53凋亡通路有关。P53 morpholino与dio3b morpholino联合注射可以逆转dio3b敲除引起的凋亡和身体变短的表型。这说明局部组织甲状腺激素信号通路的升高引起的身体变短是通过上调凋亡途径引起的。  哺乳动物的胚胎发育无法避免母体甲状腺激素水平的影响。因此在哺乳动物模型中研究脱碘酶D3在胚胎发育过程中的作用变得非常复杂。斑马鱼体外受精,我们dio3b敲除的斑马鱼模型为D3b可以独立于母体甲状腺激素水平调控胚胎大小提供了直接证据,单一基因dio3b的缺乏就可以导致斑马鱼胚胎身体变短。  胎儿发育迟缓是一种全球性的疾病,目前为止机制还不完全清楚,并且胎儿阶段的发育异常与成年的某些疾病的发生有关。我们的数据显示发育阶段脱碘作用的异常,即使是短暂异常,也可能导致胎儿发育迟缓,为临床的诊断和治疗提供了新的视角。
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