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人胰岛素样生长因子Ⅱ(insulin-like growth factor Ⅱ，IGF-Ⅱ)是一种重要的胎儿生长因子及有丝分裂原，其基因定位于染色体11p15.5，内含9个外显子(E1～E9)和4个不同的启动子(P1～P4)。E7、E8的全部和E9的第一部分编码IGF-Ⅱ前体蛋白；E1～E6 6个外显子为非翻译序列，位于该基因的5′端，其中E1、E4、E5和E6之前分别有一个不同的启动子(P1～P4)，总共编码五种5′端非翻译区不同的IGF-ⅡmRNA，但其成熟蛋白产物(67肽)却相同。在生长发育过程中，4个启动子不同的生物活性，具有组织特异性和发育阶段独立性表达特征。在胎肝和新生儿肝，IGF-ⅡmRNA表达量最高，其中P3活性最大(大约占70％)，其次分别为P4及P2，P1失活；在成人肝脏，IGF-ⅡmRNA表达量显著下调，约为新生儿峰值的1／10，其中P1活性最大(约占50％)，依次为P4、P2及P3，约70％成人肝脏P3呈关闭状态，仅30％成人呈微量表达。 近年研究发现，人IGF-Ⅱ在肝细胞癌变过程中呈过量表达状态，而且是癌变的早期改变事件。异常表达的IGF-Ⅱ通过自分泌和／或旁分泌生长调控机制直接作用于自身和／或邻近肝细胞膜上的IGF-Ⅰ受体，促使细胞从G1期进入S期，加速DNA和蛋白质等的合成，导致肝细胞恶性转化。目前认为，IGF-Ⅱ的过表达与P3、P4胚胎型启动子再活化及成人型启动子P1失活关系密切，但P3、P4再活化和P1失活的原因及调控机制尚未完全明确。暨南大学博士学位论文摘要 为此，本研究选择已知IGF一11基因无异常的L一02人胎肝细胞系作为正常对照克隆该基因的P1一P4启动子片段，并以此为基础，观察肝癌中IGF一11基因启动子碱基序列有无改变、甲基化水平变化及其与转录调控的关系，检测IGF一n基因启动子的转录调控活性，分析启动子的调节元件及其与转录因子的相互作用，以揭示肝癌中IGF一H基因各启动子活性改变的可能机制及其与IGF一11过表达的关系。第一部分人工GF一n基因P1一P4启动子克隆及序列分析 目的:克隆人IGF一n基因Pl一P4启动子并进行序列分析，以明确肝癌组织中工GF一11基因启动子碱基序列有无改变及其与转录调控的关系，为后续研究奠定基础。 方法:根据GenBank数据库提供的工GF一11基因DNA全序列及参考有关文献，应用巢式PCR技术扩增分离L一02人胎肝细胞系(正常对照)及8例肝癌组织的IGF一11基因Pl一P4启动子片段，并采用TOPO TA Cloning kit将PCR产物克隆入pCR2.1一TOPOT载体。目的DNA片段和阳性重组子分别通过琼脂糖凝胶电泳及直接测序鉴定。 结果:①L一02细胞及8例肝癌组织P1一P4启动子目的DNA片段均扩增成功，长度分别为942bp、684bp、1425bp及1246bp;②8例肝癌组织Pl~P4启动子片段的碱基序列与L一02相应的DNA序列完全相同，未见突变、缺失等改变，经与GenBank数据库(NT』09308)相比较，结果完全一致。 结论:①成功克隆了IGF一11基因Pl一P4启动子;②本组肝癌组织中IGF-11基因启动子DNA序列稳定，未见突变、缺失等改变，可能与IGF一11异常表达的转录调控机制无关。第二部分人肝癌IGF一n基因Pl~P4启动子甲基化研究目的:探讨肝癌中IGF一n基因P1~P4启动子甲基化水平变化及其对转录活暨南大学博士学位论文摘要性的影响。 方法:应用PC尺甲基化分析法及半定量RT一PCR分别检测肝癌细胞系(H即G2、SMMC一7721和Bel一7402)、8例肝癌组织及配对的癌旁肝组织、7例正常成人肝组织中IGF一H基因Pl一P4启动子的甲基化及其mRNA表达状况。 结果:①正常成人肝组、肝癌组(包括3个肝癌细胞系，下同)和癌旁肝组Pl启动子的甲基化率分别为14.30k(1/7)、81.8%(9/ll)和75.0%(6/8)，P2启动子的甲基化率分别为42.9%(3/7)、36.4%(4/11)和25.0%(2/6)，P3启动子的甲基化率分别为71.4ry0(5/7)、0.0%和12.50k(1/8)，P4启动子的甲基化率分别为71.4%(5/7)、0.0%和0.0%。肝癌组和癌旁肝组Pl启动子的甲基化率明显高于正常成人肝组(P<0.05)，而P3和P4启动子的甲基化率则都明显低于正常成人肝组(P<0.01，P<0.05)，P2启动子的甲基化率在3组间无显著性差异(P>0.05)。②正常成人肝组、肝癌组和癌旁肝组PI mRNA的表达量分别为0.27士0.034、0.05士0.028和0.09士0.040，PZ mRNA的表达量分别为0.10士0.034、0.11土0.029和0.15士0.034，P3 mRNA的表达量分别为0.04士0.027、2.20士0.427和2.99士0.654，P4 mRNA的表达量分别为0.06士0.029、0.76士0.090和1.35士0.226。肝癌组和癌旁肝组PI mRNA的表达水平均明显低于正常成人肝组(P<0.01)，而P3和P4 mRNA的表达水平则都明显高于正常成人肝组(P<0.01)，PZ mRNA的表达水平在3组间无显著性差异(P>0 .05)。 结论:①肝癌细胞系和肝癌组织中IGF一H基因Pl、P3和P4启动子常发生甲基化水平改变，即Pl启动子多出现高甲基化，而P3和P4启动子主要表现为甲基化水平降低;②IGF一H基因5‘调控区的这种异常甲基化可能与肝癌中Pl启动子失活和P3、P4启动子再活化的转录调控机制密切相关;③肝癌细胞系和肝癌组织中工GF一H基因P2启动子甲基化水平无明显变化，可能与IGF一H过表达无关。第三部分人IGF一n基因P1一P4启动子结构研?