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卵巢储备功能是指卵巢内存留的卵泡数量和质量,反映女性的生育潜能。卵巢产生卵子的能力减弱,卵母细胞质量下降,称为卵巢储备不良或卵巢储备功能下降,进一步可发展为卵巢早衰,极大威胁女性生殖健康。既往对卵巢储备功能的研究主要集中于寻找出可以预测、评判卵巢功能的指标,然而关于卵巢功能下降的确切机制研究甚少。普遍认为年龄是影响卵巢功能的最重要因素。但是卵巢衰老发生存在极大的个体差异性,提示我们卵巢内部因素比年龄更能决定生育储备。卵泡生长发育异常、颗粒凋亡加速导致卵泡闭锁是卵巢储备功能下降的根本原因。研究参与调节卵泡生长、闭锁过程的基因对于揭示卵巢储备功能下降的机制有着重要意义。目前认为卵母细胞源性生长因子对卵泡及周围细胞发育发挥重要作用。生长分化因子-9(Growth Differentiatoin Factor-9, GDF-9)是第一个被发现的卵母细胞分泌因子,属于转化生长因子-β(Transforming Growth Factor-β, TGF-β)超家族成员。已经证实,GDF-9参与了卵泡生长、闭锁；颗粒细胞增殖、凋亡；排卵发生；卵母细胞成熟；卵巢内激素及细胞因子的分泌。基于在卵泡发育成熟过程中的重要作用,GDF-9被认为是卵泡发育异常相关疾病的重要候选基因,多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome, PCOS)表现出卵巢组织GDF-9蛋白表达显著下降,卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)存在相关突变位点。而在异卵双胎母亲也发现了GDF-9基因变异。提示GDF-9在女性卵巢发育及排卵中具有重要作用。但是目前关于GDF-9基因与卵巢储备功能方面的研究至今尚无报道。本研究拟从蛋白表达和基因水平着手,分析卵巢储备功能不良女性GDF-9基因的表达、突变及其功能状态,以期揭示GDF-9蛋白分泌和基因异常介导卵巢储备功能下降发生的可能分子机制,为拯救女性生育力提供理论基础和新思路第一部分GDF-9蛋白表达与卵巢储备功能的关系及其对颗粒细胞凋亡的调控目的：检测卵巢储备功能不良女性卵泡液GDF-9蛋白及颗粒细胞p53 mRNA表达水平,并进一步研究GDF-9蛋白对颗粒细胞凋亡的调节。方法：以68例卵巢低反应患者为研究对象,同时以97例卵巢正常反应者为对照组,Western Blot分析卵泡液中GDF-9表达与卵巢反应性的关系,同时采用Real-time检测卵巢低反应患者颗粒细胞p35 mRNA表达。人黄素化颗进行原代培养粒细胞,并给予不同浓度重组GDF-9(0-300ng/mL)刺激,Real-time检测p53mRNA表达,Western Blot检测p53蛋白水平表达。结果：1.卵巢低反应患者卵泡液GDF-9蛋白表达水平显著低于正常对照组,卵巢低反应患者颗粒细胞p53 mRNA表达明显高于正常对照组；2.给予原代培养颗粒细胞不同浓度GDF-9作用24h,随GDF-9浓度的增加(Ong/ml,30ng/ml,100ng/ml, 300ng/ml),颗粒细胞p53 mRNA及蛋白表达水平均明显下降。结论：1.卵泡液GDF-9蛋白水平下降与卵巢储备功能下降相关；2.诱导颗粒细胞p53 mRNA表达上调,促进颗粒细胞凋亡,加速卵泡闭锁,可能降低的GDF-9蛋白水平参与卵巢储备功能不良发生的机制之一第二部分卵巢储备功能不良女性GDF-9基因变异研究目的：对卵巢储备功能不良女性进行GDF-9基因筛查,分析其SNPs与卵巢储备功能下降的关系,并试图揭示卵巢储备功能不良导致女性生殖潜能下降的机制。方法：以106例卵巢储备功能下降女性为研究对象,同时采集123例健康、卵巢功能正常的生育期女性外周血作为正常对照。利用直接测序法筛查卵巢储备功下降女性GDF-9基因变异情况,分析SNPs基因型与卵巢储备功能、IVF结局的关系。结果：1.直接测序结果发现了2个已知的单核苷酸多态：c.C447T,c.G546A；和2个新发突变：c.G169T(p.D57Y),c.C436T(p.R164C)。2.对于GDF-9 G546A,GA/AA基因型频率及A等位基因频率在卵巢储备下降女性中显著高于正常对照组,而GDF-9 C447T基因型和等位基因频率在两组间没有显著性差异。3.卵巢储备下降组中,与GG基因女性相比,携带GA/AA基因型女性其卵巢低反应发生的风险显著赠高,优质胚胎率和妊娠率显著降低(p<0.01)。正常对照组中,GG和GA/AA基因型在这些指标间没有显著差异(p>0.05)。GDF-9 C447T三种基因型在两组IVF结局中没有明显差异(p>0.05)。4.2个新发现突变位点,其中p.R164C仅发生于卵巢储备功能下降女性,而p.D57Y在卵巢储备下降组和正常对照组均有发生,且发生频率无明显差异。结论：GDF-9 G546A与女性卵巢储备功能不良密切相关。GA/AA基因型可能是导致卵巢储备功能不良女性发生生殖潜能降低的机理之一。第三部分GDF-9基因突变体的表达及功能研究目的：研究野生型和突变型GDF-9蛋白表达和生物学功能的差异,探讨突变GDF-9基因引起卵巢储备功能不良的发生机制。方法：利用分子克隆和定点突变技术构建野生型真核表达质粒pcDNA4-Myc/His-GDF-9wt和突变型真核表达质粒pcDNA4-Myc/His-GDF-9D57Y, pcDNA4-Myc/His-GDF-9R 164C,分别转染HEK293T细胞,经Zecoin筛选建立GDF-9稳定表达HEK239T细胞系,Western Blot分析野生型和突变型蛋白分泌情况。用野生型和突变型重组蛋白刺激原代培养人黄素化颗粒细胞,Alarm Blue研究突变型蛋白对刺激颗粒增殖能力的影响,Western Blot分析其对下游信号转导分子Smad-2磷酸化水平的作用。结果：1.p.R164C仅发生于2例卵巢储备下降患者,该位点高度保守。p.D57Y发生6例卵巢储备下降患者,同时见于2例正常对照女性(p>0.05)。2.Western Blot分析证实p.R164C导致成熟蛋白分泌显著减少,突变蛋白刺激颗粒增殖以及诱导Smad-2磷酸化的能力明显降低。p.D57Y突变不影响蛋白的分泌,并且突变蛋白对颗粒细胞和Smad-2的作用与野生型蛋白无明显差异。结论：1.错义突变p.R164C影响成熟蛋白分泌,使GDF-9蛋白刺激颗粒细胞增殖和诱导Smad-2磷酸化水平的能力下降。2.GDF-9基因突变导致的蛋白生物学活性下降可能是一部分卵巢储备功能下降患者的致病原因。