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棉花不仅是主要的纤维作物,还是重要的油料和蛋白质资源,是世界上主要的经济作物之一。棉花生产稳定与否,直接关系到整个农业生产、农民收入和纺织工业的发展。因此,对棉花品种进行不断的改良和创新,培育出更多高产、优质、抗逆的新品种,成为棉花育种家们不断追求的目标。棉花组织培养是育种研究中的有效手段,可以通过各种生物技术手段加速育种进程,提高育种效率,创造新的育种材料,并可为现代分子育种和基因工程研究提供有效的实验技术手段。棉花组织培养工作起步较晚,而且棉花是被公认的体细胞胚胎发生困难和难于体外遗传操作的作物之一。因此,研究亚洲棉体细胞胚胎发生、棉花体细胞胚胎发生的起源以及遗传规律,以及从分子水平揭示棉花细胞脱分化现象等方面的工作,是进一步完善棉花转基因体系的重要途径。本研究的主要结果如下:1对四十个亚洲棉品种进行了愈伤诱导,以及后期的分化调控处理,为建立亚洲棉再生体系积累了资料。所有的亚洲棉品种在2,4-D+KT,NAA+KT,IBA+KT三种常用植物激素组合条件下都容易诱导出愈伤,出愈率均为100%。但在不同激素组合上的愈伤状态显著不同,继代处理表明NK处理更适合于后期的分化调控处理,能够获得状态较好的愈伤。此后,通过改变培养方式、培养基组分,以及其他处理等方式或组合上述处理等方式进行分化调控,使用了近300种培养基,仅在卡宝品红染色时发现了部分类似于胚性愈伤的细胞,但未获得体细胞胚。2对YZ1进行了不同激素组合条件下的体细胞胚胎发生研究,建立了高效快速的再生体系;并利用组织切片的方法观察了体细胞胚胎发生的过程,表明不同植物激素处理条件下的体细胞胚胎发生方式是不同的。YZ1在8种植物激素（包括不含植物激素）处理上均能通过体细胞胚胎发生方式获得再生植株。但不同处理间的体细胞胚胎发生能力存在显著差异,IBA+KT处理表现出最高的分化率,可以达到97.6%,是常用植物激素组合2,4-D+KT处理中分化率28.6%的3倍。同时观察发现,整个体细胞胚胎发生过程（从外植体接种到体细胞胚的出现）仅为33天,是目前棉花体细胞胚胎发生耗时最短的报道。YZ1也能够在不含植物激素的MSB培养基上也能够获得分化。此外,组织学观察表明,2,4-D+KT和IBA+KT处理中的体细胞胚胎发生模式不同,胚性细胞团分别起源于初生形成层和皮层细胞,从一定程度上解释了IBA+KT处理能够快速促进体细胞胚胎发生的原因。3通过构建陆海杂种F1及F2群体,以及8个不同再生能力品种的完全双列杂交,研究棉花体细胞胚胎发生遗传规律。选择容易再生的陆地棉品种Coker201与再生困难的海岛棉品种Pima90杂交获得F1,利用不同植物激素组合诱导两个亲本和F1进行体细胞胚胎发生,Pima90和F1均不能体细胞胚胎发生;次年自交获得F2种子,F2个体经过半年多的诱导调控处理未见一个个体分化。随后,对容易再生的陆地棉品种Coker201,Coker312,Y668,YZ1,再生困难的陆地棉品种TM-1,EK4及海岛棉品种Pima90和Pima3-79,进行完全双列杂交,获得了47个杂种F1代种子,同样进行愈伤诱导和分化调控处理,仅有陆地棉之间的两个杂种获得了再生,且其对应的反交没有获得再生。随后,选择正反交均不能分化的F1（YZ1和EK4杂交获得）进行自交,获得的F2群体进行体细胞胚胎发生遗传规律分析;仅有YZ1作父本的F2群体中有14个个体获得了胚性愈伤,且胚性愈伤状态各异,胚胎发生能力间也存在显著差异。表明体细胞胚胎发生能力是一种复杂的遗传性状,可能同时受细胞质和细胞核内多个基因的互作控制。4构建细胞脱分化相关基因的SSH文库,对部分相关基因进行了表达分析,并提出了可能的SAM-dependent转甲基调控细胞脱分化的分子机制,部分相关基因进行了初步的功能验证。利用来自三种不同激素处理诱导6,12,24,72,168小时的下胚轴的cDNA作为tester,以下胚轴的切段作为driver,进行差异表达基因的差减和两轮PCR扩增后,获得棉花细胞脱分化相关基因的SSH差减文库。对反向Northern杂交中的差异表达明显的克隆进行测序,共有286个差异表达的cDNA克隆被测序,112个独立的EST被分离鉴定,且其中有40.2%的EST是第一次被分离鉴定,可能为新发现的棉花细胞初始脱分化相关基因。对相关基因的表达分析表明,GST在植物激素诱导初期的6-24小时内高度表达,PRPs在不同处理中优势表达并表现出不同的表达模式,表明它们可能与棉花细胞脱分化关系密切。此外,棉花SAM代谢途径中假定的GhSAMS,GhSAMDC,GhSAHH和GhAC03被鉴定,realtime-PCR分析表明,它们的表达水平在激素诱导初期出现两次明显的上升/下降过程,且GhSAMS和GhSAHH的转录表达水平表现出高度正相关,进一步推测高表达水平的GhSAMS可能与脱分化细胞重新进入细胞周期密切相关。组织形态学观察进一步表明,2,4-D处理条件下的部分细胞在72小时内完成脱分化和分裂过程,SAM-dependent转甲基途径可能通过两次转甲基活性的改变调控棉花细胞脱分化过程。此外,差异表达基因在不同处理中的表达模式表明了2,4-D和激动素之间存在着复杂的互作关系。此外,我们借助Gateway技术构建了Extensin和PRPL的RNAi干涉表达载体以及SAMS、EF1A4、PRPL的超表达载体,并利用农杆菌转化方法转化YZ1下胚轴。其中PRPL的RNAi转化的下胚轴分化率较对照明显降低,初步推测可能是PRPL的干涉影响正常的细胞脱分化进程,进而导致正常的体细胞胚胎发生进程受限。此外,三个超表达基因都已经获得了胚性愈伤和再生植株,PCR检测阳性转化率为72.73%。上述基因的准确功能还需要进一步的验证。