棉花种质资源的创新是棉花遗传育种的基础。然而,利用现有的种质资源很难进行栽培棉种的遗传改良,主要是因为许多重要的性状(抗病虫害,抗除草剂等)在棉花栽培种基因库中十分贫乏。而在棉属的野生种和近缘种广泛存在这样的有益基因,通过传统的远缘杂交将野生种的抗性基因转移到陆地棉的方法也得到了一些组合,但是由于野生种和栽培种亲缘关系较远,杂交往往很难成功,或者育性很低。因而,利用野生种和近缘种来改良栽培种和创造新的种质资源是很有必要的。利用生物技术进行棉花的种质资源创新是一条有效途径,体细胞组织培养、原生质体融合和遗传转化在棉花育种中可以发挥重要的作用,在棉花的遗传改良上具有广阔的应用前景。本研究内容主要涉及鄂抗(Ekang)系列棉种体细胞胚胎发生、G染色体组野生棉G.bickii器官发生、陆地棉和野生棉原生质体“供-受体”融合和以原生质体为受体的遗传转化。所取得的主要结果如下:1.Ekang系列棉种体细胞胚胎发生。比较了不同激素组合对鄂抗棉品种愈伤组织早期诱导、胚性愈伤组织和体胚发生的影响。结果表明,2,4-D有利于愈伤组织早期的诱导和增殖;然而,凡添加有2,4-D的培养基均未能获得胚性愈伤组织,EKang5和EKang 8在添加NAA的培养基上形成黄色和灰白色交织的颗粒状的胚性愈伤,并获得再生植株;0.5 mg/L NAA+0.1 mg/L KT和0.5 mg/L IBA+0.1 mg/L KT相对有利于棉花胚性愈伤组织的保持和体细胞胚的萌发。2.G染色体组野生棉G.bickii器官发生。对影响G染色体组野生棉G.bickii器官发生的主要因素进行了研究,包括外植体的类型和取材时间、细胞分裂素的类型和浓度。在所使用的外植体中(子叶节、下胚轴、子叶),只有子叶节能在添加BAP、TDZ或两者激素组合的培养基上诱导多芽(＞2);高浓度的BAP(4 mg/L)和低浓度的TDZ(0.1 mg/L)比较适合G.bickii的多芽形成。另外,流式细胞仪和染色体数目分析表明G.bickii所有器官发生再生的植株无变异发生;RAPD分析表明这些植株有遗传同质性。3.陆地棉和野生棉原生质体“供-受体”融合。(1)融合前,用碘乙酰胺(IOA)处理受体原生质体,紫外线(UV)处理供体原生质体。比较了IOA不同处理液,处理温度、处理时间和处理浓度对陆地棉原生质体的影响,并选取CPW9M溶液稀释IOA至终浓度为0.5 mM,室温下处理15 min为IOA处理的最佳处理条件(处理后的原生质体培养不能持续分裂,但能存活数日,甚至有少数几次分裂,同时破碎率低);比较了5个UV辐射剂量对野生棉原生质体的影响,选取38.7 J/cm~2为UV辐射的最低辐射剂量(处理后的原生质体培养不能持续分裂,但能存活数日,甚至有少数几次分裂,同时破碎率低)。将此处理条件用于后面的原生质体融合实验中。(2)比较了不同电融合参数(交流电场强度及其作用时间,直流脉冲电场强度和脉冲时间,脉冲次数)对原生质体融合的影响,选取交流电场强度为100 V/cm、作用时间为15 s,直流脉冲场强1250 V/cm、脉冲时间30μs,脉冲次数3次为电融合参数(原生质体成串短、破碎率低、融合率高)。(3)开展了4个组合的原生质体“供-受体”融合,YZ-1+G.davidsonii得到融合再生植株。大部分再生植株表现与双亲不同的形态,也有形态介于双亲之间的,还有呈现簇生状态的,少量偏向于受体亲本的;染色体数目在40到73之间变化;RAPD和SSR分子检测证实了杂种植株的真实性,cpSSR和CAPS分子检测分析表明杂种植株线粒体和叶绿体的某些区域发生了重组。这是继棉花对称融合和基于紫外线处理的非对称融合之后的又一新的进展。4.开展以原生质体为受体的遗传转化。本实验以陆地棉YZ-1和野生种G.davidsonii为材料,分离胚性愈伤悬浮系原生质体作转化受体,选用绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因,采用电击穿孔转化法,将外源质粒(pBIN m-gfp5-ER)DNA转化到棉花原生质体中,以此研究棉花原生质体遗传转化技术体系。实验中,对影响转化效率的因素进行比较实验,结果表明电场强度为1000 V/cm、脉冲时间为20μs、质粒浓度为100 ng/μl时能够获得相对较高的转化效率,为5.36%左右。在上述转化条件下,YZ-1未获得转化愈伤组织;G.davidsonii获得再生愈伤组织440个,其中5个愈伤组织块有GFP荧光表达,并获得3株转化植株。