目的:17β-雌二醇（17β-E2）能抑制血管内皮细胞（VEC）的衰老进展。然而,其潜在的分子机制仍不清楚。在本研究中,我们研究了 SIRT3在17β-E2诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）自噬,及在17β-E2介导的过氧化氢（H2O2）诱导的HUVEC衰老中的作用。方法:1.人脐静脉内皮细胞加入0、0.1、0.3、0.4μmol/L 17β-E2处理。收集细胞进行逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质印迹（western blot）分析,分别检测SIRT3基因的mRNA和蛋白表达水平。2.构建SIRT3质粒,扩增启动子片段。将基于荧光素酶的SIRT3报告质粒和阴性对照PSMD13启动子构建体分别转染到HUVEC细胞中,并将细胞暴露于不同浓度的17β-E2。然后收获细胞,最后用双荧光素酶报告分析测定荧光素酶活性。3.将人脐静脉内皮细胞转染SIRT3 siRNA,以了解SIRT3基因表达。收集17β-E2处理的细胞,用抗LC3或p62的抗体进行免疫印迹分析。4.人脐静脉内皮细胞用SIRT3 siRNA转染,用载体或0.1μmol/L 7β-E2处理。对于共处理组,细胞用0.1μmol/L 1 7β-E2预处理1小时,然后用200μmol/L H2O2在0.1μmol/L 17β-E2的存在下刺激细胞24小时。收集细胞并使用抗p-Rb或Rb的抗体进行免疫印迹分析。衰老相关的b-半乳糖苷酶染色也被用来测量衰老。5.用SIRT3 siRNA转染的人脐静脉内皮细胞用0.1μmol/L 17β-E2预处理1小时,然后用0.1μmol/L 17β-E2和200μmol/L H2O2共处理24小时。然后用抗SIRT3、VDAC1和LC3的抗体对细胞进行免疫染色。量化由SIRT3、VDAC1和LC3共同定位的细胞的百分比。结果:1.17β-E2以剂量依赖性方式增加人脐静脉内皮细胞中SIRT3基因的表达水平。与基因水平一致地是,免疫印迹分析显示,当人脐静脉内皮细胞暴露于不同浓度的17β-E2时,SIRT3的蛋白表达水平升高。2.当片段被反向定向时,它充当PSMD13基因的启动子。相反,17β-E2对PSMD13启动子没有显示任何作用。3.对照siRNA转染的细胞,17β-E2显著增加LC3Ⅱ与LC3-Ⅰ的比率,而siRNA介导的SIRT3基因表达沉默显著抑制17β-E2诱导的自噬。一致地,17β-E2诱导对照siRNA转染细胞中p62的显著降解,而SIRT3敲除显著抑制17β-E2诱导的p62蛋白水平的降低。4.在对照siRNA转染的人脐静脉内皮细胞中,H2O2导致Rb磷酸化的显著增加和17β-E2显着抑制H20 2的作用。相反,当使用SIRT3 siRNA在人脐静脉内皮细胞中耗尽SIRT3表达时,17β-E2未能阻断H2O2诱导的Rb磷酸化的增加。类似地,17β-E2显著抑制H2O2诱导的SA-b-gal阳性细胞数量的增加。然而,当我们敲除SIRT3基因表达时,17β-E2失去了阻止H2O2诱导的SA-b-gal阳性细胞数量增加的能力。5.我们进行了免疫荧光染色,分别用抗VDAC1和LC3的抗体标记线粒体和自噬体。当对照siRNA转染的人脐静脉内皮细胞暴露于H2O2和17β-E2时,在用H20 2和17b-E2处理后,SIRT3敲除削弱了这些蛋白质的共定位。结论:1.17β-E2提高了 SIRT3启动子活性,并在0.1 μmol/L的浓度下表现出最大效果。2.17β-E2诱导的自噬需要SIRT3基因的表达。3.17β-E2通过SIRT3介导的自噬抑制H2O2诱导的衰老。4.SIRT3促进H2O2诱导的自噬体和功能障碍的线粒体的融合。