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D(-)-酒石酸主要应用于化工和制药行业,是重要的手性辅助剂、医药拆分剂、手性食品添加剂和手性营养物质添加剂。D(-)-酒石酸的传统生产方法是化学拆分法,近年来,采用经济环保的微生物转化法已逐步成为D(-)-酒石酸生产技术的发展方向,即用含顺式环氧琥珀酸水解酶(cis-epoxysuccinate hydrolase, CESH)的微生物,将顺式环氧琥珀酸转化为D(-)-酒石酸。目前报道的产D(-)-酒石酸的微生物有恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)产碱杆菌(Alcaligenes)和博德特氏菌(Bordetella),其中后两者CESH酶的基因序列已报道。对产D(-)-酒石酸CESH酶的研究迄今仍局限于一级结构层面,目前尚未见从空间结构和反应机理对其进行研究的报道。本研究通过多序列比对、同源建模、分子对接、定点突变、酶学性质研究、电感耦合等离子质谱、同位素标记等方法和手段,首次揭示了博德特氏菌BK-52(Bordetella sp. BK-52) CESH酶的三维结构和催化机制。主要实验结果如下：1、序列比对和二级结构预测分析显示,产D(-)-酒石酸的Bordetella sp. BK-52CESH酶属于未知功能的原核蛋白超家族DUF849成员。2、同源建模显示,该CESH酶具有典型的(β/α)8桶状折叠结构,分子对接结果预测了该酶的活性中心位于β桶中央的C端面。3、金属离子螯合剂测试和电感耦合等离子质谱分析显示,该CESH酶是Zn2+依赖的环氧化物水解酶,并且Zn2+与CESH酶的摩尔比约为1：1。4、27个保守位点的定点突变实验、圆二色谱分析、立体特异性分析和动力学分析证实,下列8个氨基酸在该酶催化过程中起重要作用His47、His49、Arg51、Thr82、Tyrl38、Asn140、 Trp164和Asp251。结合同源建模和分子对接结果,计算了底物与各活性位点以及各活性位点之间的距离。5、CESH酶中的Zn2+起Lweis酸的作用,电感耦合等离子质谱分析显示,His47和His49残基分别充当Zn2+结合位点L1和L2。6、同位素H218O标记的单转化和多转化实验表明,水分子中的18O原子直接转移到产物中,并推测了该酶Zn2+依赖的一步法催化机制。7、该CESH酶与已报道的多数环氧化物水解酶(具有α/β水解酶折叠结构,通过两步法机制反应,并且无需任何辅酶、辅基和金属离子的参与)相比有显著差别,是一种新颖的环氧化物水解酶。