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人类大多数疾病的发生与患者的基因变异有关,而发现这些基因变异对疾病的诊断、预防和治疗都具有重要意义。遗传病分为基因病和染色体病两大类,临床遗传学是研究遗传病的诊断和预防的科学。本论文从临床遗传学的研究方向出发,从分子遗传学的水平探讨男性不育精子发生相关的基因和常染色体显性多囊肾病的遗传基础。男性不育有相当部分与睾丸的精子发生相关,而精子发生受到许多基因的调控,本研究在第一部分,克隆了Mtsarg1-β—Mtsarg1(又称为Spata3,Spermatogenesis associated 3,精子发生相关3)基因的一个新的转录本,并对Mtsarg1-β和Mtsarg1进行了特征分析。在第二部分,根据我室遗传咨询门诊常有多囊肾患者就诊,需进行生育前的遗传学诊断,首次在本室应用PCR-DHPLC或SSCP、DNA测序方法进行了多囊肾患者多囊肾病Ⅰ型基因(PKD1基因)的突变检测,在多囊肾患者中发现了一个新的无义突变、一个错义突变及一个多态,在正常人对照中发现了两种新的多态。第一部分:Mtsarg1-β的分子克隆和特征分析遗传因素在男性生精过程中起重要作用,据估计,由于遗传缺陷包括基因突变和染色体异常所引起的精子发生障碍约占男性不育的30%以上,有相当部分的男性不育有不能确认的遗传变异存在。睾丸生精细胞的增殖、分化受多种因素调控,而生精细胞内基因水平的调节,在精子发生过程中起着决定性作用。精子产生与睾丸的生殖细胞凋亡相伴随,后者同样受到许多基因的调节。发现新的与睾丸精子产生或生殖细胞凋亡相关的基因对于深入理解睾丸精子产生的生理和病理机制,对于预防、诊断和治疗男性不育和睾丸肿瘤都具有重要意义。本研究室姜宏等通过建立小鼠睾丸凋亡模型,运用抑制消减杂交法克隆出24个小鼠睾丸生精细胞凋亡相关基因的ESTs(expressedsequence tags,ESTs,表达序列标签)。傅俊江等从上述的EST(BE644538)出发,运用生物信息学和实验技术,克隆了全长1103bp的Mtsarg1基因(Mus musculus testis and spermatogenesis cellapoptosis-related gene 1,GenBank接受号:AF399971,2002年;再命名为Spata3,Mus musculus spermatogenesis associated 3,2004)。目前,我们通过逆转录-聚合酶链反应(reversetranscription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、T—A克隆以及测序克隆了一个长887bp的Mtsarg 1的新的转录本,命名为Mtsarg1-β(GenBank接受号为EU259321和EF546784,2007年,命名为Spata3,variant 4),并分析了Mtsarg1-β和Mtsarg1的特征。Mtsarg1-β与Mtsarg1具有高度相似性,Mtsarg1-β包含一个417bp的完整开放阅读框,编码138个氨基酸组成的蛋白质。Mtsarg1-β蛋白是一个理论分子量14.79kD、等电点9.74的非分泌性蛋白,其N-端的100个氨基酸与Mtsarg1一致,其后的38个氨基酸不同于Mtsarg1。成年的DBA/2小鼠的多组织RT-PCR和Northern blot分析显示Mtsarg1-β和Mtsarg1的mRNA在睾丸中特异性的高表达;RT-PCR结果也表明Mtsarg1-β和Mtsarg1在小鼠GC-1精原细胞中无表达;原位杂交显示Mtsarg1和可能Mtsarg1-β主要表达在小鼠睾丸的精母细胞中;亚细胞定位分析揭示Mtsarg1蛋白主要定位在细胞核,而Mtsarg1-β蛋白主要定位在细胞浆中。利用原核表达系统pET21-a(+)对Mtsarg1编码的产物进行了原核表达。上述这些结果表明Mtsarg1和Mtsarg1-β在小鼠睾丸的功能和精母细胞的发育中可能起重要作用。由于时间的限制,这只是一个初步的研究,今后将对Mtsarg1和Mtsarg1-β的功能进行深入研究。第二部分:多囊肾PKD1基因的突变检测目的对多囊肾患者进行基因诊断,检测常染色体显性多囊肾常见的致病基因-多囊肾病Ⅰ型基因(PKD1)的基因突变,以发现多囊肾患者的致病原因。方法对12例多囊肾患者及相关亲属进行了PKD1基因的突变检测。针对PKD1的3’端单拷贝区的12个外显子(35-46号外显子)序列采用相应的引物,以患者基因组DNA为模板进行聚合酶链反应(polymerasechain reaction,PCR)扩增。应用变性高效液相色谱(Denaturinghigh-performance liquid chromatography,DHPLC)或单链构象多态性(Single strand conformation polymorphism,SSCP)技术对PKD1基因外显子PCR产物进行突变检测。随后,对有异常峰形的PCR产物进行了测序。结果经PCR-DHPLC、DNA测序分析,在7例患者中,发现3例患者存在PKD1基因的突变,其中在患者1发现一个新的无义突变,为PKD1的42外显子的C11901A,导致原丝氨酸3897变为终止密码子。在患者2发现一个错义突变,为35外显子的C10737T,导致原苏氨酸3509变为甲硫氨酸,此错义突变以前在PKD患者中曾有报道,为致病突变。在患者3发现一个同义突变为39外显子的G11470C。在正常人对照中发现两种同义突变分别为42外显子的G11824A及C11860T。其它5例用PCR-SSCP、DNA测序方法检测的患者均未发现异常。结论成功地用PCR-DHPLC或SSCP、DNA测序方法进行了PKD1的突变检测,在多囊肾患者中发现一个新的无义突变、一个错义突变、一个多态,在正常人对照中发现两种新的多态。新的无义突变可导致患者PKD1基因编码的多囊蛋白1成为一个截短的蛋白,其氨基酸构成比正常少406个氨基酸;检测了60个正常人,均未发现上述同样类型的突变,该突变仅在患者中发现,说明是一与多囊肾相关的突变。由于没有对PKD1基因其它区域进行检测,尚不能排除还有其它致病突变的存在。