论文部分内容阅读
第一部分芹菜素对离体大鼠冠状动脉的肌源性反应目的:1.通过观察预孵芹菜素（Apigenin,API）对氯化钾KCl、血栓素类似物U46619、血管加压素（Vasopressin,VP）引起大鼠冠状动脉（Rat coronary artery,RCA）收缩的抑制作用,探讨API对各种缩血管物质收缩RCA的舒张作用;观察API对KCl、U46619、VP引起RCA收缩的舒张作用。2.观察亚硝基左旋精氨酸甲酯（NG-nitro-L-argininemethylester ester,L-NAME）、吲哚美辛（Indomethacin,Indo）对API舒张RCA作用的影响;通过观察蛋白激酶C抑制剂（Go6983）、细胞外信号调节激酶抑制剂（PD98059）和p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂（SB239063）对API舒张RCA作用的影响,探讨其作用机制;利用Ca2+激活的Cl-通道（Ca2+-activated Cl-channels,Ca CCs）抑制剂Ca CCinh-A01,研究钙激活氯通道与API对RCA舒张作用之间的关系。3.通过向无钙PSS液中加入Ca Cl2,探讨API对RCA的舒张作用与细胞内外钙的关系。4.通过预孵无Cl-溶液,观察无氯环境对API舒张大鼠RCA作用的影响。方法:1.将SD大鼠（成年雄性,260-290g）使用戊巴比妥钠（40mg/kg）麻醉后,断头放血,立即取出心脏,并迅速放于预先准备好的生理盐溶液中。本实验需要分离心脏的三种直径大约为230-260μm的冠状动脉,分别为前降支、室间隔支和室壁支,并剪成长度为2mm的血管环。在正式实验前,分离好的血管环需要进行去内皮的操作,避免内皮对实验进行干扰,然后再把去内皮干净的血管环悬挂于微血管环张力记录仪的浴槽内?孵育血管环的同时进行张力标准化,目的是使实验开始前血管环的前负荷为80mm Hg,持续稳定1h,每15min换液一次。使用60m M KCl反复刺激,RCA收缩强度与前次相比,差别不超过10%,收缩强度至少大于2m N,认为血管环活性和反应的重复性良好,可以进行药物作用的实验观察,实验前离体RCA血管环制备完成。2.向浴槽中分别累积加入KCl（20、28、39、55、77、108m M）、U46619（0.01、0.03、0.1、0.3、1μM）、VP（0.1、0.3、1、3、10μM）,制作收缩量效曲线,当其每次达到坪台时的差别小于10%,向浴槽中加入API（10、30或100μM）,预孵30min,再次重复上述收缩量效曲线,分别以未预孵API前的各收缩剂最大浓度引起RCA收缩幅度为100%,计算预孵API前后,不同收缩剂各浓度引起冠状动脉收缩的百分比,计算API抑制RCA收缩50%时所需要的药物浓度（IC50）。3.向浴槽中分别加入KCl（60m M）、U46619（1μM）或VP（1μM）预收缩到达坪台,向浴槽中累积加入API（1、3、10、30、100μM）,建立API的浓度-舒张效应曲线,以各收缩剂刺激RCA达到坪台时的最大收缩幅度为100%,计算API对不同收缩剂收缩RCA的舒张百分比。4.使用60m M KCl或1μM U46619预刺激RCA,待血管环达到收缩坪台后,加入30μM API舒张血管,待血管到达舒张坪台后,洗脱血管,以此作为观察前对照,稳定30min,再次使用60m M KCl或1μM U46619收缩血管到达坪台后,向浴槽内分别加入各种抑制剂:L-NAME、Indo、Go6983、PD98059、SB239063、Ca CCinh-A01,预孵10min后,加入30μM API,观察各种阻断剂对API舒张RCA作用的影响。以RCA的最大收缩强度为100%,计算加入各抑制剂前后RCA的舒张强度。5.将正常PSS液换为含有EGTA的无钙PSS液预孵15min,使细胞外液达到无钙状态,换为不含EGTA的无钙PSS液预孵15min,再更换为不含EGTA的无钙60m M KCl或1μM U46619,到达血管收缩坪台后加入2.5m M Ca Cl2,待血管收缩再次达到坪台后,洗脱血管,将此作为观察前对照。加入30μM API预孵15至20min,重复上述操作。观察预孵API前后,RCA无钙和复钙时收缩幅度的变化。6.向浴槽中加入60m M KCl或1μM U46619刺激RCA到达收缩坪台后,加入30μM API达到舒张坪台后,洗脱血管环,以此作为实验前对照,将浴槽内液体换位无氯的PSS液,无氯的PSS液为正常PSS液中的氯离子被等摩尔浓度替代（氯化钾、氯化钠和氯化钙分别用葡萄糖酸钾、葡萄糖酸钠和葡萄糖酸钙代替）,使用此无氯PSS液预孵30min,再次用60m M K+或1μM U46619刺激血管环,达到收缩坪台后加入30μM API,观察无氯对API舒张预刺激的RCA作用的影响。结果:1.预孵API（10、30、100μM）可以抑制KCl（20、28、39、55、77、108m M）、U46619（0.01、0.03、0.1、0.3、1μM）、VP（0.1、0.3、1、3、10μM）对RCA的收缩作用,收缩曲线向右下移动。RCA对KCl、U46619、VP的最大收缩幅度分别为（10.67±3.37）m N、（4.77±1.37）m N、（5.97±3.07）m N?预孵API对RCA收缩幅度的最大抑制率分别为（97.63±1.48）%、（100.05±0.08）%、（98.98±1.74）%;IC50分别为22.36、20.71、14.21μM。与正常组相比,差异均具有显著性（P<0.05）。2.API可以浓度依赖性舒张被60m M KCl、1μM U46619、1μM VP预收缩的RCA,最大舒张幅度分别为（95.43±3.50）%、（92.49±4.48）%、（95.60±3.61）%（P<0.05）。RC50值分别为（19.89±2.15）μM、（27.19±1.04）μM、（7.043±1.35）μM。对照组对相同条件下预收缩的RCA无明显影响。3.API对60m M KCl预收缩RCA的舒张百分比为（66.79±3.42）%,预孵抑制剂Indo（0.01m M）和SB239063（3μM）对API舒张RCA作用无明显影响（P>0.05）。预孵抑制剂Go6983（0.1μM）、PD98059（3μM）、Ca CCinh-A01（10μM）、L-NAME（0.01m M）,API对60m M KCl预收缩的舒张比分别为（27.89±5.10）%、（29.41±4.11）%、（19.34±6.10）%、（30.34±2.13）%,差异具有显著性（P<0.05）。API对1μM U46619预收缩RCA的舒张百分比为（80.83±4.11）%,预孵抑制剂Indo（0.01m M）和SB239063（3μM）对API舒张RCA作用无明显影响（P>0.05）。预孵抑制剂Go6983（0.1μM）、PD98059（3μM）、Ca CCinh-A01（10μM）、L-NAME（0.01m M）,API对1μM U46619预收缩的舒张比分别为（41.13±5.21）%、（39.07±5.15）%、（38.18±3.97）%、（38.58±6.20）%,差异具有显著性（P<0.05）。4.在无钙PSS环境中,60m M KCl刺激能够引起RCA小幅度的收缩,复钙之后RCA的最大收缩幅度为（4.41±0.06）m N,预孵30μM API后,可以抑制RCA在复钙后的收缩幅度,复钙后RCA的最大收缩幅度为（1.00±0.09）m N,差异具有显著性（P<0.05）。在无钙PSS环境中,0.3μM U46619预刺激几乎不能引起RCA收缩,复钙后,RCA达到的最大收缩幅度为（3.19±0.11）m N,预孵30μM API后,同样可以抑制RCA在复钙后的收缩幅度,最高收缩幅度为（0.73±0.11）m N,差异具有显著性（P<0.05）。5.在正常PSS环境中,API对60m M KCl或1μM U46619预收缩RCA的最大舒张比分别为（66.79±3.95）%、（65.20±4.12）%,更换为无氯的PSS孵育30min,API对60m M K+或1μM U46619预收缩RCA的最大舒张比变为（41.83±5.08）%、（44.10±2.13）%,与对照组相比,差异具有显著性（P<0.05）。结论:1.API（10、30、100μM）对KCl、U46619、VP引起的RCA收缩均有不同程度的抑制作用;API对KCl、U46619、VP预收缩的RCA有浓度依赖性的舒张作用。2.钙激活的氯通道特异性抑制剂Ca CCinh-A01和无Cl-,均可以减弱API对RCA的舒张作用,表明API对RCA的舒张作用可能与Ca CCs有关;细胞外信号调节激酶抑制剂PD98059、PKC抑制剂Go6983均可以减弱API对RCA的舒张作用,表明API对RCA的舒张作用可能与ERK1/2、PKC活性改变有关;L-NAME可以减弱API对RCA的舒张作用,表明API舒张RCA的作用机制可能与NO有关。3.API对细胞外钙内流所致的RCA收缩具有抑制作用,表明其血管舒张作用与抑制钙内流有关。第二部分芹菜素对离体大鼠冠状动脉平滑肌细胞钙激活的氯通道电流的影响目的:研究API对大鼠冠状动脉平滑肌细胞（rat coronary arterial smooth muscle cell,RCASMC）Ca CCs电流的影响。方法:1.RCASMCs的分离:大鼠冠状动脉分离完毕后,迅速转到已预热至37℃,含有1mg/ml二硫丁四醇,1mg/ml牛血清白蛋白,0.5mg/ml木瓜蛋白酶的1ml细胞分离液中,持续供氧,氧气气泡不宜开太大。水浴恒温加热,孵育25至28min,转至含有0.3mg/ml胶原酶H,1mg/ml牛血清白蛋白,0.6mg/ml胶原酶F的0.7ml细胞分离液中,持续孵育5-8min,调大供氧气泡,然后加入预热的细胞分离液至1ml,继续孵育2-4min,加入4℃的分离液至试管顶部,将分离好的细胞离心两次,弃去上清,得到新鲜分离的RCASMCs。将其存入4℃冰箱备用,8小时内用于全细胞膜片钳电生理学实验?2.Ca CCs电流的记录:采用全细胞膜片钳实验技术,记录正常的Ca CCs电流,待记录稳定后,在细胞槽中加入Ca CCs特异性的阻断剂10μM Ca CCinh-A01,证实所记录电流为Ca CCs电流后,再次记录正常Ca CCs电流,加入30μMAPI,观察API对Ca CCs电流的影响。结果:使用去极化电压程序-100m V+100m V刺激引起电流,30μM芹菜素可以减弱Ca CCs电流。在测试电压为+100m V时,RCASMCs Ca CCs电流的稳定峰值为561.55±102.58p A,电流密度为26.30±1.38p A/p F。加入10μM Ca CCinh-A01后,可以抑制峰值电流密度,证明所记录电流为钙激活的氯电流,抑制率为（56.72±3.75）%（P<0.05）。加入30μM API后,Ca CCs电流被抑制,抑制率为（66.75±11.20）%,与正常组相比,差异具有显著性（P<0.05）。结论:30μM API可以抑制RCASMCs Ca CCs电流。