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花瓣形态是花卉观赏价值和商品价值的集中体现。近年来,花瓣形态建成(petalmorphogenesis)已成为发育生物学研究的焦点之一。花瓣形态建成除受自身遗传程序控制外,还受其它多种因素如激素和光等的调节。研究这些因素在花瓣形态建成中的作用,有助于了解花瓣发育的生物学机制,同时也为利用基因工程手段改良花卉品质提供理论基础。
非洲菊(Gerberahybrid)是世界上著名的观赏和切花植物,其头状花序属于复杂花序,含有三类不同类型的小花:外围的舌状花(rayfloret,rf)、中央的盘花(discfloret,df)和处于二者之间的过渡花(transfloret,tf)。它们形态、色彩和结构各异,可以代替突变体的作用,是研究复杂花序花瓣形态建成精细调控机制的理想模式体系。本论文以非洲菊花序为实验材料,系统研究花瓣形态建成的细胞学基础、赤霉素(gibberellinsacid,GA3)和脱落酸(abscisicacid,ABA)在花瓣形态建成中的调控作用以及GA3和光信号调控花瓣生长发育的互作方式。
本论文研究工作主要包括以下:
第一,非洲菊三种花瓣生长动态变化规律研究。
首先,从器官水平考察非洲菊花瓣从Stage1到Stage6的生长发育特征。结果发现,尽管非洲菊三种花瓣都表现出比各自前一期显著地(P＜0.01)生长趋势,但是它们的生长规律明显不同。Rf花瓣生长最快,最大扩展速率出现最早(长度最大伸长速率出现在Stage2,宽度最大加宽速率出现在Stage4),df花瓣生长最慢,最大扩展速率出现最晚(Stage6),tf花瓣生长速度居于二者之间,最大扩展速率出现在Stage4;缘于此,非洲菊花序从Stage1到Stage6任一时期内,花瓣形态大小都表现出明显的rf＞tf＞df的生长发育规律。
其次,利用琼脂糖印迹和石蜡切片技术,从细胞水平上探索花瓣大小差异的原因。结果发现,对任一种花瓣而言,从Stage2到Stage6细胞数目基本上都没有明显增多。但是,细胞尺寸却表现出和花瓣大小一致性的增加。因此,细胞扩展,而不是细胞增殖,才是非洲菊花瓣生长的主要原因。分析三种花瓣之间在Stage2到Stage6各个时期的细胞数目差异,并对应比较细胞大小关系,发现是细胞数目和细胞大小共同决定了非洲菊花瓣尺寸上的rf＞tf＞df规律。
最后,分析了非洲菊花瓣的非互补型生长发育规律。测定三种花瓣细胞数目和细胞大小发现,在Stage2到Stage6各个时期,rf花瓣细胞数目是tf和df花瓣细胞数目的1.5～5倍,而rf花瓣的细胞大小表现在长度和宽度上在各个时期仍然大于tf和df花瓣细胞的长度和宽度。尤其是在基本组织处,rf花瓣细胞长度是tf和df花瓣细胞长度的2倍左右,宽度是它们细胞宽度的1.2～3倍。很显然,rf花瓣细胞数目增多时,其细胞体积并没有发生减少来补偿,从而致使花瓣增大。因此,非洲菊花瓣的生长发育属于非互补型生长模式范畴。
第二,探索了GA3和ABA在花瓣形态建成中的调控作用。
首先,利用高效液相色谱技术分析了内源激素GA和ABA与花瓣生长的关系。结果发现,花瓣内源活性GA4水平表现出rf＞tf＞df的规律,rf花瓣GA4的含量分别是tf和df花瓣的6.65和17.42倍,这与非洲菊三种花瓣生长发育规律一致。而且,生长较快的花瓣,在早期有较高的GA4含量,且有较低的ABA含量,而生长较慢的花瓣与之相反,这与花瓣最快生长速率出现时间早晚表现为rf＞tf＞df的现象一致。显然,内源激素GA和ABA以相反的作用方式调控非洲菊花瓣的生长发育。GA抑制剂多效唑(paclobutrazol,PAC)抑制花瓣生长而ABA抑制剂氟啶草酮(fluridone)促进花瓣生长的实验结论进一步支持了GA和ABA在花瓣生长中的调控作用。
其次,考察了外源GA3和ABA对非洲菊花瓣生长动态的调控作用。结果显示,非洲菊小花离体培养下,GA3对花瓣的伸长和加宽,几乎在培养的各个时期都表现出显著地(P＜0.01)促进作用;但是,GA3对花瓣生长的最大促进作用出现在培养的后期(7d以后)。相反,在离体培养的大部分时期,ABA对花瓣的伸长和加宽都有明显的抑制作用;ABA对花瓣生长的最大抑制作用出现在培养的中后期(5d后)。GA3促进和ABA抑制花瓣生长的现象都能被各自的抑制剂所逆转,并且GA3和ABA对花瓣生长的调控作用规律在非洲菊活体植株上也得到了良好验证。
最后,探索了GA3和ABA调控花瓣形态建成的细胞学基础。结果发现,非洲菊小花离体培养3、6、9d,花瓣最宽处的上表皮、基本组织和下表皮的细胞扩展大部分都可以受GA3促进,而且这种促进作用也能被PAC的介入所减弱;相反,ABA表现出对花瓣细胞生长的抑制作用,而且这种抑制作用也能被其抑制剂所减缓。因此,在花瓣形态建成中,GA3和ABA是通过调节细胞大小来调控花瓣的生长发育。GA3通过促进细胞扩展来促进花瓣生长,ABA则通过减小细胞尺寸而抑制花瓣发育,二者在非洲菊花瓣形态建成中存在着相反的调控作用。
第三,研究了GA3和光信号在花瓣形态建成中的互作机制。
首先,考察了GA3和光信号对花瓣生长发育的作用模式。结果发现,与黑暗相比,光不仅能促进花瓣的快速伸长,而且也能显著(P＜0.01)促进花瓣加宽。同样与黑暗相比,GA3仅能使花瓣的长度增加,对宽度没有影响。而且,光对花瓣长度的促进作用受到GA3的增强,但光对花瓣宽度的促进作用则受到GA3抑制。这表明,rf花瓣的伸长受到GA3和光信号的协同正向调控,但rf瓣的加宽仅受到光信号的正向调节。
接着,探索了GA3和光信号互作调控花瓣生长的细胞基础。实验发现,无论是在黑暗或者光下,与培养前相比,花瓣细胞数目都没有发生明显变化,这表明,光信号促进花瓣生长与细胞增殖无关。尽管在GA3存在时,花瓣细胞数目会有一定程度的增加,但是增加幅度远低于花瓣大小变化幅度,这足以说明,GA3诱导的花瓣生长主要不是由细胞增殖所致。实际上,GA3和光信号对细胞大小的调节与它们对花瓣的调节是一致的。与黑暗相比,光能明显促进花瓣细胞的伸长和加宽;黑暗下施加外源GA3,花瓣细胞长度明显增加,而宽度没有发生变化;GA3能够进一步增强光对细胞伸长的促进作用,但对光促进的细胞加宽有显著地(P＜0.01)抑制作用。总之,GA3和光信号对花瓣生长的调控依赖于对细胞大小的调控。
其次,考察了皮层微管(microtubules,MTs)排列对GA3和光信号的响应。结果发现,在暗处,rf花瓣细胞MTs排列呈现出自由无序的状态,T、O和L型MTs比例相当。光或光+GA3处理下,rf瓣细胞的MTs排列出现了明显变化,T型MTs所占比例显著(P＜0.01)增加。单独光下培养时,其花瓣细胞T型MTs的比例明显多于黑暗+GA3培养下的,这与光比黑暗+GA3更能明显促进花瓣和花瓣细胞生长的结果相一致。此外,在光+GA3条件下,花瓣细胞的MTs排列都会呈现T型排列,这与该条件下花瓣和细胞长度都达到最大是相呼应的。这些结果暗示着MTs以不同的排列方式来响应GA3和光信号,从而参与到GA3和光信号对细胞及花瓣的调控过程。
再次,考察了MTs稳定性对GA3和光信号的响应。结果发现,光下培养,长度大于＞6μm的MTs要比黑暗培养下的多,这说明光信号有助于维持MTs稳定性。微管抑制剂oryzalin解聚MTs后,GA3在一定程度上可以恢复MTs的长度。这暗示GA3在维持细胞MTS稳定性中也有重要作用。
最后,我们借助微管抑制剂oryzalin,考察了MTs在GA3和光信号调控细胞和花瓣生长中的作用。结果发现,oryzalin能明显减弱光或者光+GA3对细胞和花瓣伸长的促进作用。同时,oryzalin也能抑制光对细胞和花瓣宽度的促进作用,尽管可能由于和GA3效应叠加,oryzalin对光+GA3诱导的细胞和花瓣加宽没有影响。这些结果说明,MTs在GA3和光信号调节的细胞和花瓣生长中起到重要作用。
总结以上,本论文对非洲菊头状花序花瓣的形态建成做了全面基础性探索研究,在得出非洲菊花瓣形态建成遵循非互补模型基础之上,深入剖析了花瓣形态建成中的细胞学基础、微管骨架作用以及GA3、ABA和光信号互作调控机制。相关结论的取得有助于深入了解花瓣形态建成的精细调控机制和信号作用网络。进一步的深入研究,有望能为花卉产业化发展及花卉品质遗传改良提供助力和理论基础。