【摘 要】
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目的构建携带人TNF-α基因的双靶向5/35嵌合型的溶瘤腺病毒载体,并研究该腺病毒对胃癌细胞的杀伤作用。方法用RT-PCR从PCD DNA-TNF-α质粒中获得人TNF-α基因,将该基因用分子
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目的构建携带人TNF-α基因的双靶向5/35嵌合型的溶瘤腺病毒载体,并研究该腺病毒对胃癌细胞的杀伤作用。方法用RT-PCR从PCD DNA-TNF-α质粒中获得人TNF-α基因,将该基因用分子克隆技术插入到溶瘤腺病毒基因组中,得到病毒载体穿梭质粒PPE3-F35-TNF-α。用Lipofectαmine2000将PPE3-F35-TNF-α 与SG502-EGFP共转染至293细胞中,溶瘤腺病毒载体在细胞内包装生产,扩增、纯化病毒。病毒滴度用TCID50方法测定。用MTT法观察PPE3-F35-TNF-α对胃癌细胞的杀伤作用。用ELISA检测TNF-α的表达情况。结果限制性内切酶鉴定及PCR结果表明,携带TNF-α基因的双靶向5/35嵌合型溶瘤腺病毒载体构建成功,命名为PPE3-F35-TNF-α。人TNF-α重组腺病毒滴度达2×1011 pfu/ml,在MOI=1时,PPE3-F35-TNF-α即可引起肿瘤细胞明显凋亡,MOI=100时也没有明显杀伤正常细胞MRC-5的作用。用ELISA分别检测三组细胞TNF-α浓度,实验组(1474.86±71.33ng/ml)与空载对照组(14.06±0.92ng/ml)、空白组(15.84±2.57ng/ml)比较,差异性有显著统计学意义(P<0.01)。结论PPE3-F5/35-TNF-α能在胃癌细胞中增殖并杀灭肿瘤细胞,对正常细胞无损伤,TNF-α重组溶瘤腺病毒的构建为胃癌基因治疗的进一步研究奠定基础。
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