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近年来,频繁爆发的甲型流感不仅给人类的生命健康带来了严重威胁,而且给经济造成了巨大损失,甚至影响到了社会稳定。通过气溶胶传播、扩大感染范围是其能引起全球大流行的一个重要因素。2009年爆发的甲型H1N1流感就是因病毒能经气溶胶传播,具有强大的人传人能力,而被世界卫生组织(WHO)将警戒级别提至最高级—6级。该事件进一步引发了人们对流感病毒气溶胶传播机理研究的关注。但是目前对于流感病毒的气溶胶传播机制还不是十分清楚。影响流感病毒气溶胶传播效率的因素有很多,如环境因素、流感病毒自身的关键位点氨基酸序列、宿主呼吸道唾液酸相关的受体类型、体内的抗病毒药物或疫苗免疫水平、在呼吸道的沉积效率等。与研究病毒气溶胶扩散动力学同等重要的是,监测具有气溶胶传播特性的流感病毒在感染宿主过程中呼吸道内载量的动态变化,能为流感病毒的组织嗜性、复制与清除规律、致病与传播分子机制的研究提供基础数据和技术支撑,对于进一步研究流感病毒的气溶胶传播机制具有重大意义。目前,传统的病毒体内沉积研究方法需要大量使用动物,在不同的时间点剖检,不仅费时、费力,而且存在较大的生物安全隐患。而活病毒标记及可视化研究能够有效克服上述不足,可以实时、便捷地反映病毒感染过程。本课题利用反向遗传操作技术,在甲型H1N1流感病毒A/PuertoRico/8/34(PR8)的NA末端插入外源荧光素酶基因Gluc(Gaussia luciferase),构建可视化的重组荧光素酶甲型H1N1流感病毒(IAV-Gluc),为开展流感病毒动物感染研究提供了一种实时、动态、可视化监测呼吸道病毒载量变化的方法。该方法通过检测活体动物呼吸道生物发光情况,快速确定病毒的组织分布及载量情况,实现对动物体内病毒载量连续、实时的动态监测,具有操作简便、结果直观、可快速定性定量等特点。本研究共分四部分:一是完成了IAV-Gluc的构建与鉴定。以A/Puerto Rico/8/34(PR8)毒株为骨架,利用反向遗传学技术成功构建8个双向转录/表达质粒,将8个质粒共转染293T细胞(人胚胎肾细胞),转染上清接种9日龄的SPF鸡胚,进行重组病毒IAV-Gluc拯救。通过凝集试验(HA)、基因扩增、形态学观察、荧光素酶基因表达水平的验证和鉴定,均证实了重组荧光素酶甲型H1N1流感病毒(IAV-Gluc)构建成功,且该病毒能够稳定表达Gluc。二是完成了IAV-Gluc生物学特性研究。本研究从稳定性、致病性、传播能力、增殖能力、NA活性及受体结合特性六个方面对拯救毒株IAV-Gluc的生物学特性进行了分析比较。结果表明,IAV-Gluc能够在P1-P5代稳定表达荧光素酶基因,且在5代间表达无显著差异;致病力约为野生毒PR8的1/1000;在豚鼠间获得了100%的直接接触传播与气溶胶传播能力,与野生毒株一致;在SPF鸡胚上增殖能力约为野生毒的1/20,增殖曲线无明显差异;与野生毒的神经氨酸酶相对活性不存在显著性差异,表明对病毒的释放能力无影响;二者均表现出完全的α2,3唾液酸受体结合能力。上述结果表明获得的IAV-Gluc除致病力减弱外,极大地保留了野生毒株的生物学特性。三是完成了IAV-Gluc在呼吸道内沉积的可视化监测研究。本研究结合体外成像技术,分析了病毒在小鼠体内复制、清除的动态过程。以IAV-Gluc滴鼻感染BALB/c小鼠(5×103EID50/只)后,利用IVIS SPECTRUM体外成像系统对其体内的病毒载量进行连续6天的可视化监测,24h即能在体外检测到生物发光信号,48h后达到峰值。生物发光来源为小鼠肺部和气管,且肺部的生物荧光强度与病毒滴度有极强的正相关线性关系(R2=0.9866);同时,建立了生物发光快速鉴定病毒感染的方法,相比于传统的qRT-PCR技术来说,不仅可以直接评价动物体内活病毒载量,而且在保证准确性前提下,大大缩短了样品处理步骤和实验所需时间。四是完成了不同感染方式下IAV-Gluc在呼吸道内沉积与复制的比较研究。当保证滴鼻与气溶胶暴露两种方式下攻毒的剂量相同(2.43×105 EID50)时,滴鼻时有12.27%的病毒到达豚鼠肺部且呈点状分布,气溶胶暴露时有1.34%的病毒到达豚鼠肺部且呈均匀分布,后者导致病毒在48h内更加有效的复制;从复制效率来看,气溶胶暴露感染组的豚鼠肺部病毒载量持续增高48h后才开始下降,最高载量为原始沉积量的11073倍,而滴鼻感染组的豚鼠肺部病毒载量在24h开始下降,且最高载量仅为原始沉积量的15.4倍。说明气溶胶暴露方式感染更有利于病毒在肺部的复制,比滴鼻方式具有更高的感染效能。本研究成功构建了携带Gaussia Luciferase基因的可视化重组荧光素酶甲型H1N1流感病毒(IAV-Gluc);从稳定性、致病性、传播能力、增殖能力、NA活性及受体结合特性等方面鉴定,结果显示该重组病毒极大地保留了野生毒株的生物学特性;滴鼻感染小鼠后在肺部和气管内可检测到生物发光信号,并且生物发光强度与病毒滴度呈正相关;该病毒适用于对感染动物的快速鉴定研究,在前处理和检测时间上优于传统的qRT-PCR技术,而且能够直接评价体内的活病毒载量;同时,利用可视化病毒进行气溶胶暴露研究首次发现,甲型H1N1流感病毒气溶胶暴露比滴鼻感染在豚鼠肺部增殖持续时间更长,载量更高,分布更均匀,具有更高的感染效能。本研究为进一步评价甲型流感病毒的体内沉积与体外传播规律研究、阐明其致病分子机制和抗病毒药物的筛选及候选疫苗株的研发提供基础,同时为开展其他亚型流感病毒研究提供技术参考。