基于片段化萤光素酶重组发光的microRNAs便携式检测技术研究

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Micro RNAs(mi RNAs)作为细胞中的关键调控因子,影响着人体的生长、发育等过程。近年来的研究表明,mi RNAs在肿瘤等重大疾病的产生和发展发挥了关键作用。同时,释放到人体循环系统中的mi RNAs也可以成为肿瘤早期诊断的潜在标志物。然而,由于传统mi RNAs检测方法存在的操作繁琐、灵敏度有限和依赖大型仪器等问题,阻碍了基于mi RNAs的诊断技术在经济、技术落后地区的应用。因此,在保证灵敏度和特异性的前提下,建立一种简便易行、成本低廉的mi RNAs检测技术将为普及肿瘤早期筛查,提高我国经济落后地区医疗服务水平奠定技术基础。在本工作中,我们基于蛋白质自标记技术设计、构建了高信背比的片段化萤光素酶-DNA嵌合体探针。通过将上述探针与滚环扩增(Rolling Circle Amplification,RCA)体系相结合,利用廉价的智能手机实现了人体外周血中肺癌mi RNAs标志物的高灵敏度检测。具体工作内容如下:(1)通过在片段化纳米萤光素酶(Nano Luciferase,Nluc)上融合具有自标记功能的SNAP Tag,实现了上述片段与单链DNA(Single Strand DNA,ss DNA)的等比例共价交联。由此构建的片段化萤光素酶-DNA嵌合体可通过碱基互补配对作用对DNA模板产生特异性的信号传感,其信背比可达175.3。(2)通过将上述嵌合体探针与专门设计的RCA体系相结合,利用酶标仪实现了肺癌标志物mi R-21的高灵敏度检测,其检测限为23.4 a M。相对于未经扩增的mi R-21生物发光检测体系,其灵敏度提高了7个数量级。此外,相对于现有核酸生物发光检测方法,其灵敏度提高了至少5个数量级。(3)为了验证上述方法在即时检验(Point-of-Care Testing,POCT)中的适用性,我们进一步利用廉价的智能手机作为便携式检测设备,对本方法的分析性能进行了评估。研究表明,mi R-21的检测限为11.2 a M,与酶标仪检测结果一致。同时,基于智能手机的检测可准确区分mi R-21靶标的单碱基突变。(4)为了进一步验证上述方法在不同mi RNAs检测中的通用性,我们分别对肺癌标志物mi R-148b和常用的外参靶标cel-mi R-39进行了分析。结果表明,上述两种靶标的检出限分别为15.9 a M和16.3 a M,且具有单碱基特异性。因此,本方法可适用于不同mi RNAs的检测,具有良好的通用性。(5)最后,我们验证了本方法在临床诊断中的应用潜力。通过对健康组和肺癌组(各12个样本)血清样本进行分析,可检测出mi R-21和mi R-148b在上述两种样本中的表达差异,且结果与实时荧光定量聚合酶链式反应(q RT-PCR)一致。因此,本方法具有较高分析性能,同时具备仪器成本低廉、操作简便的优势,因而为基于mi RNAs标志物的临床诊断提供了新的工具。
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