BCL2L10是一种抗细胞凋亡的BCL-2家族成员,研究表明,其大量而特异性的表达于成年人和小鼠的卵母细胞及早期胚胎,对卵母细胞成熟和早期胚胎发育起到重要的促进作用。本研究旨在探讨水牛BCL2L10在水牛各组织中的表达及其对水牛卵母细胞体外成熟的影响,以期进一步明确水牛卵母细胞的成熟机理,为提高水牛卵母细胞体外成熟率提供一定的理论指导意义。本研究包括三个试验:1.水牛BCL2L10基因的克隆及其在各组织中的表达。结果表明,克隆所得的基因为600 bp,编码区序列长度为558 bp,共编码185个氨基酸。序列分析显示克隆所得基因的核苷酸序列与牛、绵羊、小鼠、野猪、人的同源性较高,氨基酸序列同源性较低,表明BCL2L10蛋白在不同物种间发生了一定的进化;通过生物信息学技术对BCL2L10蛋白进行结构及功能预测,发现水牛BCL2L10蛋白为跨膜性蛋白,通过C端跨膜结构域锚定在细胞膜或细胞器膜上,属于BCL-2蛋白家族成员,可能参与细胞凋亡调控过程。实时荧光定量试验结果表明,水牛BCL2L10基因主要表达在卵巢组织中,在睾丸组织中也有少量的表达,而在其他组织中未检测到表达,而其对立互作对象BAX基因在水牛各个组织中均能检测到表达。2.水牛BCL2L10及其对立互作对象BAX在卵母细胞成熟及早期胚胎发育中的表达。利用免疫组织化学、免疫荧光染色及实时荧光定量PCR等手段检测BCL2L10及BAX在水牛卵巢、卵母细胞成熟过程及各阶段早期胚胎中的表达模式。结果表明,水牛BCL2L10蛋白在卵巢中的表达主要集中在卵母细胞上,颗粒细胞与卵丘细胞上无表达。在水牛卵母细胞成熟过程中BCL2L10均有表达,且表达呈上调趋势,而BAX基因的表达在此过程中没有明显的变化。在水牛早期胚胎发育过程中,BCL2L10基因的表达呈现一个先上调再下调的趋势,且在8细胞期表达量最高,而BAX基因在8细胞前低表达,8细胞后快速上调,在囊胚期表达量最高。3.利用siRNA干扰技术抑制BCL2L10基因的表达对水牛卵母细胞体外成熟的影响。利用阳离子脂质体转染的方法将siRNA转染进GV期水牛卵母细胞,探讨下调水牛卵母细胞BCL2L10基因的表达后对水牛卵母细胞体外第一级体排出率和孤雌激活卵裂率的影响。结果表明,利用siRNA干扰技术可以有效的抑制水牛卵母细胞BCL2L10基因转录水平的表达,与空白组和阴性对照组相比,下调BCL2L10基因的表达可以使水牛卵母细胞的体外成熟率及孤雌激活卵裂率显著下降(48.18%、46.65%vs 33.5%;54.72%、61.32%vs 37.52%,p<0.01)。同时,对BAX、BCL-2、Caspase-3、Caspase-9四个基因的表达水平进行检测,以验证下调BCL2L10基因表达后对凋亡相关基因的影响。结果表明下调BCL2L10基因的表达后Caspase-9基因的表达水平显著上调(p<0.05),细胞启动凋亡程序。综上所述,(1)水牛BCL2L10基因编码区为558 bp,共编码185个氨基酸,BCL2L10蛋白在不同物种间发生了一定的进化,且主要表达于卵巢组织,其作用对象BAX广泛表达于各组织;(2)BCL2L10蛋白在水牛卵巢组织中的表达主要集中在卵母细胞上,BCL2L10与其作用对象BAX在水牛卵母细胞成熟过程中及水牛早期胚胎发育过程中均有表达;(3)利用siRNA干扰下调BCL2L10基因的表达使卵母细胞体外成熟率显著下降,可能是下调BCL2L10基因的表达可以导致Caspase-9基因的表达上调,启动细胞凋亡程序,中断卵母细胞的成熟分裂。