希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsianum Sacc.）是炭疽菌属中一种典型的半活体营养型真菌,在世界范围内主要危害十字花科植物（包括模式植物拟南芥）,引起炭疽病,造成严重的经济损失。效应分子是病原物分泌的、作用于植物质外体或细胞内的、能调节寄主与病原物相互作用的蛋白质,所以也叫效应蛋白。真菌效应分子可以通过操纵寄主生理过程或抑制寄主免疫,以利于病原真菌的侵染。但目前关于希金斯炭疽菌效应分子的研究并不多。本研究在实验室前期预测和筛选的基础上,对10个希金斯炭疽菌候选效应分子进行再次筛选,并对筛选得到的一个能稳定引起烟草叶片细胞死亡,且在侵染阶段有特异性表达的效应分子ChEP085进行深入功能分析,旨在明确该效应分子的功能,以期更好地了解希金斯炭疽菌的致病机理,为寄主与病原物互作研究提供理论依据。首先对10个候选效应分子进行了基因表达模式分析,探究希金斯炭疽菌侵染拟南芥后各个候选效应分子基因的表达情况,同时克隆得到10个候选效应分子基因,并构建到PVX表达载体后,以能够引起烟草叶片细胞坏死的致病疫霉（Phytophthora infestans）激发子INF1为阳性对照,分析这些候选效应分子是否能引起本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片细胞坏死。通过上述实验筛选得到可以引起本氏烟草叶片细胞坏死的效应分子ChEP085。对ChEP085进行生物信息学分析,预测其信号肽,并将缺失信号肽序列分别构建到PVX载体和增强型绿色荧光蛋白载体p Bince GFP上,分析信号肽对ChEP085诱导烟草叶片细胞死亡、抑制INF1诱导的坏死反应的影响以及ChEP085的亚细胞定位。然后在烟草叶片瞬时表达ChEP085后接种灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers.）,研究其对烟草抗病性的影响。最后利用ATMT技术对ChEP085基因进行定向敲除和回补试验,对敲除体进行生物性状观察和致病力测定,对回补体进行致病力测定,从而阐明了效应分子ChEP085的功能。详细结果如下:1、效应分子ChEP085基因的特性。希金斯炭疽菌效应分子基因ChEP085的序列长度为675 bp,无内含子,编码224个氨基酸,翻译产物为假定蛋白。信号肽为1～21氨基酸,未发现已知功能的结构域。基因表达模式分析表明,ChEP085基因在接种24 h后有特异性高表达,并且在用含效应分子基因ChEP085的农杆菌注射烟草后,ChEP085是10个候选效应分子中唯一一个能稳定引起烟草叶片细胞坏死的效应分子。2、效应分子ChEP085信号肽的功能。将含有效应分子基因ChEP085的农杆菌注射到烟草中,进行瞬时表达,发现效应分子ChEP085（蛋白）能够诱导烟草叶片细胞坏死,去除信号肽后仍然可以诱导叶片细胞坏死,说明信号肽不影响ChEP085的功能;ChEP085不论全长还是去除信号肽序列皆不能抑制INF1引起的叶片细胞坏死;亚细胞定位实验表明ChEP085定位在细胞膜,信号肽的缺失影响其精确定位。3、效应分子ChEP085对烟草抗病性的影响。在本氏烟草中瞬时表达效应分子ChEP085 2 d后接种灰葡萄孢,结果能促进灰葡萄孢对烟草的侵染,这可能是ChEP085发挥了其自身的毒力功能帮助病原菌侵染的结果。4、效应分子ChEP085对希金斯炭疽菌生物性状和致病力的影响。定向敲除效应分子ChEP085基因后,基因敲除突变体与野生型菌株在菌落形态、菌丝生长速率、菌丝生物量、菌丝尖端形态、菌丝机械穿透力上并没有明显差异;但基因敲除突变体菌株（?）ChEP085-2和（?）ChEP085-8的产孢量随着摇培时间不同而变化,摇培5 d、6 d后基因敲除突变体产孢量略高于WT或与WT持平,摇培7 d、8 d后WT菌株显著高于基因敲除突变体的产孢量;其次,孢子萌发及附着孢形成情况也不同,WT菌株的分生孢子萌发后产生芽管并形成一个黑化的附着孢,而基因敲除突变体分生孢子萌发后产生较长的芽管,芽管上不产生黑化的附着孢,只有极个别的才会产生附着孢;在分生孢子萌发率上,基因敲除突变体（?）ChEP085-2显著低于WT,而（?）ChEP085-8与WT菌株无显著差异;在附着孢形成率上,基因敲除突变体都显著低于WT菌株,说明效应分子基因ChEP085影响菌株附着孢的形成。在致病力上,（?）ChEP085-2和（?）ChEP085-8对拟南芥和菜心的致病力与WT菌株相比有所下降。通过随机回补的方式对ChEP085基因进行回补并验证后,进行接种实验,结果表明有3个基因回补突变体能恢复致病力。说明ChEP085基因不但参与调控希金斯炭疽菌分生孢子萌发和附着孢的形成,而且是希金斯炭疽菌发挥致病力所必需的基因。