种质资源是植物传统育种和基因工程育种的基础。超低温保存是目前国际上公认为最理想的长期保存植物种质资源的方法。苹果是世界上最重要的果树之一。中国是世界上最大的苹果生产国，是苹果属种质资源的起源中心。苹果病毒病害一直是制约苹果生产持续发展的重要因素。苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus, ASPV）和苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus,ASGV）是危害苹果生产的重要病毒。栽培无毒苗是目前国际上防治苹果病毒病的有效途径。茎尖超低温脱毒是近年来建立的一种新的脱毒技术。本研究旨在建立简易、高效的苹果茎尖超低温保存技术，并利用该技术尝试对ASPV和ASGV病毒的脱除。1．建立了简单、高效的苹果茎尖包埋-干燥法超低温保存技术。以‘嘎啦’试管苗为试材(Malus×domestica Borkh.‘Gala’)，从4周苗龄试管苗取茎尖（2mm，含5-6片叶原基），用2.5%的硅藻酸钠溶液在0.1M CaCl2溶液中，将茎尖包裹成5mm直径的小球，每个小球含一个茎尖，将小球在含有0.5M蔗糖的预培养基上培养7d，然后在超净工作台中空气干燥6个小时后，将小球转入1.8mL的冷冻管中（每个冷冻管中盛10个小球），直接投入液氮中保存。保存后的茎尖在38oC水浴中解冻2min，培养在后培养基上再生植株。后培养基成分为MS附加30g L-1蔗糖，0.25mg L-1BA,0.01mg L-1IBA和8g L-1琼脂，培养8周后可获得发育良好的植株(≥5mm)。将该技术应用于7个苹果基因型（4个种和1个杂交种），再生率最高的是‘嘎啦’（75%），最低的是‘望山红’（Malus×domestica‘Wangshanhong’，36%）。组织学切片观察结果表明，超低温冷冻后，只有顶端分生组织和幼嫩叶原基的大部分细胞成活，茎尖才能再生正常植株。2.建立了苹果茎尖小滴-玻璃化法和玻璃化法超低温保存技术。以‘嘎啦’试管苗为试材，从4周苗龄的试管苗取茎尖（2.0mm，含5-6片叶原基），在含有2M甘油和0.8M蔗糖的液体MS培养基中预培养1d。在小滴-玻璃化法中，将预培养过的茎尖用植物玻璃化溶液（PVS2）处理40min，然后转入铝箔条上的PVS2（6μL）小滴中，直接投入液氮中保存。在玻璃化法中，将预培养过的茎尖用PVS2处理30min后，转入含有100μl PVS2的冷冻管（1.8mL）中，直接投入液氮中保存。经小滴-玻璃化法和玻璃化法超低温保存的茎尖在含有1.2M蔗糖的MS培养液中卸载20min，转入后培养基上再生。将两种超低温保存技术用于测试苹果6个基因型（4个种和1个杂交种）。3.三种超低温保存技术冷冻效果的比较。包埋-干燥法的成活细胞数和再生率高于小滴-玻璃化法和玻璃化法，再生速率较快。三种方法冷冻后的成活茎尖均产生三种再生类型：愈伤组织、叶片（没有茎段伸长）和茎。三种再生类型在包埋-干燥法中的比例分别为4.8%、18.7%和76.5%；在小滴-玻璃化法中的比例为29.4%、11.2%和59.4%。包埋-干燥法受季节影响较大，而小滴-玻璃化法较为稳定，两种方法在冬季（10-12月）保存时的再生率最高。用ISSR和RAPD法对三种超低温保存技术冷冻后再生植株的遗传稳定性进行检测，没有发现异常条带。流式细胞仪（Fow Cytometry，FCM）检测没有发现染色体倍性的变化。4．用茎尖（≥0.5mm）超低温处理和热处理结合茎尖（≥0.5mm）超低温处理分别脱除了ASPV和ASGV病毒。以带ASPV和ASGV病毒的‘M9’和‘M26’试管苗为试材，茎尖（≥0.5mm）培养不能脱除ASPV。用小滴-玻璃化法茎尖超低温处理脱除了ASPV病毒，‘M9’和‘M26’所取茎尖为0.5-1.0mm时，脱毒率为85.1%和80.3%；茎尖大小为1.0-2.0mm时，脱毒率为57.6%和62.8%。热处理（36oC/30oC，16h光周期，60d）结合茎尖培养（茎尖≥0.5mm）和单一的茎尖（≥0.5mm）超低温处理不能脱除ASGV病毒。而‘嘎啦’经热处理结合茎尖超低温处理能脱除ASGV病毒，取茎尖为0.5-1.0mm时脱毒率为57.1%，1.0-2.0mm的茎尖脱毒率为50%。免疫组织化学法定位ASPV和ASGV在茎尖的分布表明，ASPV只能在第四片以外的叶原基和顶端分生组织靠下的部位有分布，而ASGV病毒在顶端分生组织区域和幼嫩叶原基中都有分布。用病毒在茎尖的定位与超低温冷冻后成活细胞在茎尖的分布，揭示了超低温处理能脱除ASPV，难脱除ASGV的原因。本研究获得的结果为建立苹果种质资源超低温库和生产无毒苗提供了技术支撑。