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铝毒是酸性土壤中限制植物生长的主要因素之一。传统改良酸性土壤的方法是使用石灰和络合剂,但效果不理想。因此,我们研究植物抗铝的生理生化机制,利用基因工程技术培育转基因耐铝植物品种来提高植物抗酸性土壤中的铝毒能力和持续生产力。本研究以铝抗性丹波黑大豆为实验材料,克隆其超氧化物歧化酶基因（GmSOD）和过氧化氢酶基因（Gm CAT）。构建GmSOD基因原核表达载体,诱导纯化蛋白,并分析其酶学特性。构建植物过表达载体p K-35S-GmSOD,转化烟草获得到过表达GmSOD烟草,分析转基因烟草在铝胁迫下根的相对生长量（RRG）、过氧化氢（H2O2）含量、抗氧化酶系统酶基因表达及其活性以及其他铝胁迫相关生理生化指标,并分析这些生理指标间的关系,揭示烟草应答铝胁迫生理生化机制。与此同时,以转GmSOD基因烟草为材料,转化Gm CAT基因获得过表达GmSOD和Gm CAT双转基因烟草愈伤组织,并初步探讨了双转基因对烟草愈伤组织中内源H2O2含量的影响以及H2O2对烟草生长和发育的调控。获得以下主要研究结果:1从丹波黑大豆根中克隆出GmSOD基因全长,成功构建了GmSOD原核表达载体,并在BL21中诱导表达蛋白,纯化得到GmSOD蛋白。酶学特性分析表明GmSOD的最适温度为60℃,热稳定性较好;最适p H为7.5,在5.5-9范围比较稳定,酸碱稳定性较好,但p H值小于5.5或大于9时酶活性明显受到抑制而容易失活。1m M K+、Mg2+、Ca2+和Al3+会激活酶活性,且激活作用K+＆gt;Mg2+＆gt;Ca2+＆gt;Al3+,3m M金属离子浓度时会抑制酶活;3m M Cu2+和Mn2+都会抑制酶活,但是抑制程度不同,Cu2+抑制作用更强;Na+对酶活影响较少。2利用Gateway技术成功构建了GmSOD基因植物表达载体p K2WG-35S-GmSOD,通过农杆菌p MP90转染烟草,获到了转GmSOD基因烟草。在0、50、100、200和400μM铝溶液中栽培烟草7天,野生型烟草根尖H2O2含量和丙二醛（MDA）含量均显著高于转基因烟草,表明转基因烟草比野生型烟草抗铝能力强。利用SPSS对野生型烟草和过表达GmSOD基因烟草根尖分泌柠檬酸应答铝胁迫相关因素,包括胁迫时间、胁迫浓度、H2O2含量、MDA含量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶（SOD）酶活、过氧化物酶（POD）酶活、过氧化氢酶（CAT）酶活、抗坏血酸谷过氧化物酶（APX）酶活、PM H+-ATPase的因子分析,结果表明影响烟草铝胁迫应答的主要两个因子是“抗氧化力”和“铝毒害力”。低铝浓度胁迫时（野生型烟草＆lt;100μM,转基因烟草＆lt;200μM）,烟草根尖中的“抗氧化力”大于“铝毒害力”,烟草中累积的H2O2浓度低(0.35-0.6μmol g-1FW),可诱导抗氧化酶的表达,提高抗氧化酶活性,维持根中低H2O2含量。低浓度H2O2作为信号分子促进质膜H+-ATP酶（PM H+-ATPase）的磷酸化水平及其与14-3-3蛋白的结合,提高烟草根尖PM H+-ATPase水解活性和H+泵活性,促进柠檬酸的分泌,提高抗铝毒能力。且酶活变化表现出一定的时间规律,无论是野生型烟草还是转基因烟草,都先是SOD基因表达量和酶活迅速增加,24 h达到最高;然后CAT、POD、APX基因表达和酶活增加,48 h达到最高。高铝浓度胁迫时（野生型烟草＆gt;100μM,转基因烟草＆gt;200μM）,烟草根尖中的“抗氧化力”小于“铝毒害力”,产生高浓度的H2O2抑制PM H+-ATPase磷酸化,从而抑制与14-3-3蛋白互作水平,降低PM H+-ATPase活性和H+泵活性,减少柠檬酸的分泌。3将利用Gateway技术成功构建的Gm CAT基因的植物过表达载体p K2-35S-Gm CAT通过农杆菌p MP90转染过表达GmSOD烟草,获得了转GmSOD和Gm CAT双基因烟草愈伤组织。愈伤组织生长发育异常,只分裂不分化成丛芽,测定烟草愈伤组织内源H2O2发现其含量低于0.1μmol g-1FW。将愈伤组织移植到添加外源0.235μM H2O2MS培养基上培养7天,愈伤组织内源H2O2增至0.1μmol g-1FW以上,愈伤组织生长发育良好,出芽率升高。采用逆转录聚合链式反应（RT-PCR）分析未添加/添加H2O2培养基上双转基因烟草的与生长发育相关的有丝分裂原激活的蛋白激酶（NPK1）、钙调蛋白激酶（Ca MK）、谷氨酸-乙醛酸转氨酶（GGAT）和促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）酶基因表达,结果显示添加外源H2O2,植物体内的这些基因表达量会升高,说明在烟草中同时过表达GmSOD和Gm CAT两种基因,导致体内分解H2O2的速率高于生成速率,使体内H2O2含量过低(小于0.03μM g-1FW),不能作为信号分子调控植物正常生长发育。